荧光蛋白发光综述.doc

xx学报 xxxx.荧光蛋白及其发光原理介绍Xxx（xxxx xxxx xxx xxxxx）摘要 本文介绍了荧光蛋白的来源，基本结构和发光机理，并通过与电子行业中广泛应用的无机固体发光材料进行比较，提出荧光蛋白可行的应用前景。关键词 ：荧光蛋白，生色团，发光原理，应用前景1 引言 自然界有许多生物能够发光。多数生物发光过程是通过小分子有机化合物荧光素和荧光素酶的化学反应释放出光能。然而有一类荧光物质不仅能在化学能激发下发出荧光，还能被光激发-荧光蛋白。荧光蛋白种类很多，其中最有应用价值的是在最早在多管水母中提取的绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白化学性质稳定，分子量约27000，为238个氨基酸残基组成的单链结构。在溶液中可形成二聚体或四聚体桶状晶体。其荧光发射峰在509nm , 最大激发波长为395 nm , 并在470 nm 处有一肩峰。由绿色荧光蛋白为蓝本通过基因技术合成的突变体发射光谱在整个可见光波段，因此在生物荧光标记方面得到广泛的应用，2008年诺贝尔化学奖也授予下俢村，钱永健等在此方面做出贡献的科学家。2 绿色荧光蛋白基本结构 绿色荧光蛋白分子呈圆柱桶状。Yang等的研究表明, GFP是由两个相当规则的内含一个2螺旋和外面包围11个2折叠链的2桶状结构组成的二聚体。图1 绿色荧光蛋白结构蛋白质前端环化形成生色团。生色团的结构可以人工改造，从而发出不同波长的荧光。生色团一经形成其化学性质便十分稳定，又能通过桶装蛋白质外壳给予其足够的保护，只有遇到强化学或者温度环境时才会遭到破坏，而且还具有一定的自我恢复能力。正是这样的特殊结构使得荧光蛋白具有稳定的发光能力。图 2 生色团环化形成示意图如图所示，蛋白质二聚体端基环化氧化后能够发生质子化以及顺-反异构变化，因此导致分子能级发生变化，具有发光能力。 生色团在蓝光照射下，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点那是被标记了的活动目标。对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前，是根本不可想象的。3 荧光蛋白发光原理3.1荧光蛋白光激发发光原理 荧光蛋白发光类型属于斯托克斯位移型，其基本原理是生色团在较高能量的光子照射下发生构象的改变，从而导致分子能级变化，从高能级的构象跃迁向低能级时发出较低能量的光子。生色团在发光过程中主要有两种化学过程。一是质子转移，即质子化和去质子化，二是分子构象的改变。生色团主要有三种构象：A型、B型以及中间过渡态Z型。在分子构象变化的同时还伴随着氢键的生成和断裂，以及电荷的传递去质子化和质子化的分子构象不同，对应的分子能级也不同，从而其发射光谱中有两个特征峰，代表两种跃迁过程。质子化构象生色基团通过Tyr66 的脱质子状态(酚盐) 和质子化状态(酚羟基) 的转换决定荧光发射。 由于酚的激发态酸性远大于其基态, 故仅脱质子态的结构发射荧光。这个过程是十分迅速的，因此荧光蛋白发射的是荧光而不是磷光，需要激发光源持续存在才可连续发光。但是其极快的激发响应使得荧光蛋白适合作为高灵敏度生物探针以及生物成像材料。图3 生色团构像变化及发光过程3.2 通过荧光共振能量转移激发的发光原理3.2.1 荧光共振能量转移过程 荧光共振能量转移（FRET）是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（1-10nm），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射的，给予体分子被激发后，当接受体分子与给予体分子相距一定距离，且给予体和接受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的给予体将把一部分或全部能量转移给接受体，使接受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果接受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果接受体也是一种荧光发射体，则呈现出接受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。 能量供给体接受体（DA）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。3.2.2 荧光共振能量转移激发荧光蛋白发光的介绍水母中存在水母发光蛋白，该蛋白可以通过生物能激发发射蓝光来激发绿色荧光蛋白发射绿光。这是自然界利用能量转移发射多色光的例子。人们在此基础上受到启发，利用结构相似但生色团不同的荧光蛋白组成FRET对，可以制作成高灵敏度分子探针。还可以在没有合适的激发光源条件下实现特定荧光蛋白发光。4 荧光蛋白发光性质以及与传统半导体材料的比较4.1 不同种类荧光蛋白发光性能根据绿色荧光蛋白的基本结构，人们利用基因技术开发出许多生色团结构不同，发射谱不同的荧光蛋白。各种荧光蛋白的量子效率和亮度不尽相同。可以看到荧光蛋白荧光颜色丰富，量子效率较高，激发光能量要求较低。表1不同种类荧光蛋白发光性质已经有大量的荧光蛋白的基因改造突变体被开发出来，它们的荧光颜色几乎具有涵盖所有可见光的色谱（表1）。科研工作者对多管水母中的绿色荧光蛋白的改造产生了很多新的突变体，颜色从蓝到黄，这些荧光蛋白都已经广泛用于生命科学的研究中。长波长的荧光蛋白（发射光在橙色和红色光谱区域内，穿透力强），适合用于荧光示踪，以及生物体成像。另外还发现有一些种类中有类似青色、绿色、黄色、橙色、和深红色荧光蛋白。正在进行的研究工作集中在开发更稳定，荧光强度更大的荧光蛋白上。4.2 荧光蛋白与传统半导体材料发光性能比较 下表是传统发光二极管所使用的无机半导体物料和所它们发光的颜色表2 传统半导体材料发光颜色可以看出半导体材料发光颜色较为单一，在颜色显示方面仅能完成组合，较荧光蛋白的色彩丰富度相差甚远。而且半导体材料在生物成像方面是无能为力的。但是半导体材料发光亮度高，性能稳定，可以电激发，能够复合到电子电路中。相比之下荧光蛋白暂时只能光激发和化学能激发，还不能整合到电子电路中。所以还应该进一步研究开发荧光蛋白电激法以便能够制作电子器件，获得更广泛的应用。总结与展望荧光蛋白以其稳定的化学性质，优秀的发光性能在生物成像领域以及分子标记中广泛应用。人们也可发出各种各样的新型荧光蛋白，例如光激活荧光蛋白，光转换荧光蛋白等满足不同领域的需要。由于其发射光颜色覆盖整个可见光波段，所以具有非常好的显示以及成像性能。又因荧光蛋白是高分子化合物，可以在液相条件下发光，具有制成纤薄柔软，色彩丰富的显示器材料的潜质。但是其本身不能电致发光以及相比无机材料的化学稳定性较差的缺点阻碍了在显示方面的应用。可电致发光的新型结构有待科研人员去突破，而利用进行简单激发光源激发多种荧光蛋白的思路也是一种可能。可以设想，如果上述问题得到解决，我们会制作出色彩比传统显示器丰富得多，携带运输方便。低能耗的新型显示器。参考文献1 马金石2009 化学通报3 2432 Fan yang 1997 Ph.D.The molecluar structure of green fluorescent protein（Texas：Rice university）3Katujusa Brejc, Titia K 1997 Proc.Natl.Acad.Sci 94 23064王伟,刘祥林,李久蒂 1999 生命的化学19 2755刘祖强, 胡敏, 齐义鹏 2000武汉大学学报(自然科学版) 46 2116杨杰，张智红，骆清铭 2010 生物物理学报11 1025The introduction of Fluorescent protein and its Light-emitting mechanismPengdong Wang AbstractThe source of the fluorescent protein were introduced in this paper, the basic structure and the luminescent mechanism, and with inorganic solid luminescent