不同产地的蒲公英中绿原酸定性鉴别与含量测定.doc

不同产地的蒲公英中绿原酸定性鉴别与含量测定邱志宏，张淑慧（河北省人民医院药学部，河北 石家庄市 050051）摘要 目的：测定不同产地蒲公英中绿原酸含量。方法：薄层色谱法定性鉴别，高效液相色谱法含量测定，色谱条件为：Sino Chrom ODS-BP C18柱（5m, 4.6mm250mm ），流动相为0.02molL-1磷酸二氢钾缓冲液甲醇（7030），流速1.0mlmin-1 ，检测波长323nm。结果：回归方程：绿原酸Y=1.60X+0.00154，r=0.9995，平均回收率(n=3)为99.4%，RSD为0.96%。结论：东北产地蒲公英中绿原酸含量最高，湖北产地绿原酸含量最低。关键词 不同产地；绿原酸；薄层色谱法，高效液相色谱法 中图分类号 文献标示码 B 文章编号Determination of Chlorogenic Acid and Caffeic Acid in Taraxacum from different habitats(Qiuzhihong,Zhangshuhui Department of Pharmacy,Hebei General Hospital,Shijiazhuang 050051)ABSTRACT：OBJECTIVE To determine the content of chlorogenic acid in Taraxacum from different habitats. METHODS using the G-TLC measurement to measure chlorogenic acid； HPLC analysis was performed on a Sino Chrom ODS-BP C18 column(5m, 4.6mm250mm)，0.02molL-1 phosphate buffer-methonal(70: 30) as mobile phase. the flow rate was 1.0mlmin-1 and the detection wavelength at 323nm 。RESULTS chlorogenic acid Y=1.60X+0.0015，r=0.9995，the average recovery was 99.4%. CONCLUSION The content of chlorogenic acid of Taraxacum(Dongbei province) is the highest, The content of chlorogenic acid of Taraxacum(Hubei province) is the lowerestKEY WORD：different habitats； chlorogenic acid；TLC；HPLC 蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand）属于菊科植物1，以全草入药，在我国各地分布广泛，蒲公英被誉为“天然抗生素”，具有广谱抗菌作用2。蒲公英药用资源极为丰富，目前最常用的有6个产地。本文用薄层色谱法定性鉴别不同产地蒲公英中的绿原酸，用高效液相色谱法测定不同产地蒲公英中绿原酸含量。测定结果表明，不同产地蒲公英中绿原酸含量有明显差异，为制剂选用地道药材提供依据。1 仪器与试药2695型高效液相色谱仪，2487型紫外检测器，Empower色谱工作站，美国Waters公司；色谱柱Sino Chrom ODS-BP（4.6mm250mm,5m ），大连依利特分析仪器有限公司；恒温干燥箱（山东潍坊精鹰医疗器械有限公司）；甲醇为HPLC级，美国Fisher公司；薄层层析硅胶G（青岛海洋化工有限公司制造, 化学纯）；乙酸乙酯（北京北化精细化学品有限责任公司，AR,20071230乙酸）；丁酯（天津市化学试剂一厂，AR,060728），盐酸（石家庄试剂厂，AR,071123）；甲酸（天津市化学试剂一厂，AR,051213）；冰乙酸（天津市永大化学试剂开发中心出品，AR,20060600）；乙醚（天津市富宇精细化工有限公司，AR,071115），氢氧化钠(天津化学试剂三厂, AR)；羧甲基纤维素钠（天津市光复精细化工研究所，化学纯,20040506）； 绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110753-200413）；药材：河北、河南、湖北、东北、山东、内蒙干燥蒲公英全草。2 方法与结果2.1 薄层鉴别2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取110C干燥至恒重的绿原酸标准品2mg于棕色瓶中，加甲醇10mL制成0.2mg/mL的溶液，作为对照品溶液。2.1.2绿原酸供试品溶液的制备 取蒲公英药材500g，加913倍量水，静置30min，加热煮沸1.5h，趁热过滤，得滤液，药渣再加6倍量水，加热煮沸1h，趁热过滤，弃去药渣，得滤液，合并滤液，浓缩，经过两次醇沉、回流后，即得蒲公英膏子，称取1g蒲公英浸膏，加乙酸乙酯液摇匀提取2次，每次10mL。合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL，使溶解做为供试品溶液。2.1.3 薄层展开 取对照品溶液10uL，供试品溶液5uL点于同一硅胶G薄层板（含1%CMC-Na）上，以乙酸丁酯-甲酸-水（10：2：3）的上层清夜作为展开剂，饱和15-20min，展开距离12-13min，自然晾干。在紫外灯（365nm）下检视。在绿原酸对照品相应位置显示有蓝色和蓝绿色荧光斑点。样品薄层色谱图如下（图1）。2.2 含量测定2.2.1色谱条件 色谱柱：Sino Chrom ODS-BP C18（5m, 4.6mm250mm ），流动相：0.02molL-1磷酸二氢钾缓冲液甲醇（7030），流速：1.0mlmin-1 ，检测波长：323nm，进样量：10l。2.2.2溶液的制备2.2.2.1对照品溶液的制备 精密称取咖啡酸对照品20mg，置100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀即得0.2mgmL-1咖啡酸对照品贮备液；精密称取绿原酸对照品20mg，至100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀即得0. 2 mgmL-1绿原酸对照品贮备液。2.2.2.2供试品溶液的制备 取蒲公英药材500g，加913倍量水，静置30min，加热煮沸1.5h，趁热过滤，得滤液，药渣再加6倍量水，加热煮沸1h，趁热过滤，弃去药渣，得滤液，合并滤液，浓缩，经过两次醇沉、回流后，即得蒲公英膏子，膏子用微孔滤膜过滤两次，再稀释30倍，即得供试品溶液。 2.2.3 线性关系的考察 分别精取浓度为20、40、60、80、100 gmL-1的咖啡酸对照品溶液10L ，按上述色谱条件分别进样，以咖啡酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程Y=2.59X+0.0049，r=0.9997，在20100gmL-1范围内呈线性关系（n=5）；分别精取浓度为10、20、30、40、50 gmL-1的绿原酸对照品溶液10L ，按上述色谱条件分别进样，以绿原酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程Y=1.60X+0.0015，r=0.9995，在1050gmL-1范围内呈线性关系（n=5）。2.2.4 精密度试验 取高、中、低3个浓度的对照品溶液，在上述色谱条件下，每个浓度重复进样3次，进样量10L，计算精密度：咖啡酸RSD1.226%、绿原酸RSD 1.774%。2.2.5 稳定性试验 取供试品溶液，在室温下放置，分别在0、1、3、5、7h测定咖啡酸和绿原酸的峰面积，结果表明咖啡酸和绿原酸在7h内稳定，RSD分别为0.84%和1.65%。2.2.6 加样回收试验 分别精密吸一定量的对照品溶液，依次加入精密吸取已知河北产地供试品，按供试品溶液制备项下处理，在上述色谱条件下进样分析，回收率结果见表1。表1 咖啡酸、绿原酸回收率试验结果Tab1 Results of recovery test of Chlorogenic Acid（n=3） 编号 样品含量g 对照品加入量g 测得量g 回收率% 平均值% RSD%1 0.144 0.256 0.392 97.972 0.144 0.342 0.483 99.69 99.10 0.713 0.144 0.427 0.587 99.21 4 0.040 0.126 0.165 99.015 0.040 0.167 0.210 100.90 99.40 0.96 6 0.040 0.209 0.246 98.012.7 不同产地蒲公英中绿原酸含量测定 不同产地的蒲公英药材按供试品溶液制备项下处理后，在上述色谱条件下进样分析，用外标法计算蒲公英中咖啡酸、绿原酸的含量，结果见表2，色谱图见图1。表2 不同产地蒲公英中咖啡酸、绿原酸含量Tab2 The content of Caffeic Acid and Chlorogenic Acid in Taraxacum from different habitats编号 产地 绿原酸含量（mgg-1）1 河北 0.03422 河南 0.03393 湖北 0.02654 东北 0.04055 山东 0.02906 内蒙 0.0313 A B图1色谱图Fig1 HPLC chromatogramsA. 对照品 (reference substance) B.蒲公英药材（Taraxacum）Lys. 咖啡酸（Caffeic Acid） kfs. 绿原酸（Chlorogenic Acid）图2七个产地蒲公英原药材中绿原酸薄层图谱数据4 讨论在薄层鉴别中所用硅胶G板均为6g硅胶G加3倍量的水并加1%羧甲基纤维素钠于研钵中向同一方向研匀，静置2-3分钟待消泡后手动铺板，于水平台晾干后置恒温干燥箱中110C活化30min，取出轻放入干燥器中备用，认为此厚度及该温度下活化的硅胶板用于点样效果优于其他用量,配比及其他温度下活化的硅胶板。在绿原酸薄层层析实验采用乙酸丁酯冰乙酸水（10：2：3）的上层