DNA重组技术与定点突变在生物酶工程中的研究应用进展.doc

DNA重组与定点突变技术在生物酶工程中的研究进展2005414 刘小艳 动物遗传育种摘要 本文简要介绍了DNA重组技术与定点突变技术，着重概括了它们在多种酶研究中的应用状况关键词 DNA重组 定点突变 酶 研究进展 生物酶工程又称高级酶工程。它是在化学酶工程的基础上发展起来的，是酶学与DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物1。随着计算机技术、化学理论以及蛋白质结构与功能相互关系的研究进展，生物酶工程技术会得到了越来越广泛的应用。1 DNA重组技术在生物酶工程中的应用11 DNA重组技术对多数生物来说，基因本质是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重组（DNa recombination）2 DNA重组是由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触而传递大段DNA遗传信息的现象，称为接合。细菌和放线菌均有接合现象。高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组3。1977年美国科学家首次用重组的人长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。此后，运用基因重组技术在生产新型酶等领域中取得了很多成果，预计下世纪将发挥更大的作用。12 DNA重组技术在酶研究中的应用1.2.1 质粒介导的AmpC酶AmpC酶是一组头孢菌素酶，不被克拉维酸所抑制，多数由染色体介导，主要见于阴沟肠杆菌，费劳地枸橼酸杆菌，粘质沙雷菌及铜绿假单胞菌，可被8内酰胺类抗生素诱导。然而，近年来出现了AmpC内酰胺酶由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移的趋势4。质粒介导的AmpC酶在底物和抑制剂特性上，质粒编码的AmpC酶与染色体编码的AmpC酶相似，但其水解底物的范围更大。1.2.2 重组谷氨酰胺酶(GA)GA是肿瘤细胞利用Gin进行酵解的起始酶和关键酶，肿瘤细胞内GA的活性直接影响细胞内Gin代谢的活跃程度5 因此封闭GA基因就完全可能阻断肿瘤细胞内Gin的酵解，进而影响其生长和增殖等生物学特性，从重组质粒PGA104中获得目的片断02kbGAcDNA反向克隆在PcDNA30的EcoRI和Hind两酶切位点间，则构建出CMV启动子控制的大鼠GA反义真核表达载体。PCNA是一种核内蛋白。观察表明：反义GA重组质粒转染人结肠癌细胞后，细胞生长速度明显变慢，增殖期细胞明显减少最终造成肿瘤细胞生长受抑制6。1.2.3 基因重组葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶能够催化D木糖、D一葡萄糖等醛糖转化为相应的酮糖，是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆的关键酶。高果糖浆是自60年代崛起的新食糖资源，在全世界范围内尤其是在发达国家发展极快，现美国的高果糖浆消费量已与蔗糖持平，而我国是一个缺糖国家，目前高果糖浆生产量和消费量较低。随着人民生活水平提高和国内饮料工业的迅速发展，我国已成为高果糖浆发展潜力最大的国家，基因重组葡萄糖异构酶的产业化将促进高果糖浆工业的发展并带来极大的经济效益7。1.2.4 基因工程纳豆激酶纳豆激酶(nattokinase)是日本学者须见洋行等人于1987年首次从纳豆中发现的。该酶是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆杆菌(Bacillus subtillisrtatto)产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶 8。 近年来，国内许多学者热衷于纳豆激酶的研究，渴望将其开发成为新一代的溶栓新药。随着纳豆激酶分子生物学方面研究的不断深入，使研制基因工程纳豆激酶药物成为可能。利用基因工程技术，人们可以自由操作纳豆激酶基因。可以通过构建高表达载体，优化表达系统来提高纳豆激酶基因的表达水平9。1.2.5 大肠杆菌中表达人胸苷激酶(hTK)hTK与细胞的增殖和分化密切相关。特别是在一些肿瘤病人的体液中明显增高，而在正常人的体液中hTK很微量。肿瘤病人体液中hTK的来源尚不十分清楚，推测可能是细胞破碎释放或瘤细胞分泌的结果。并且已证明肿瘤细胞内hTK也呈异常表达1012。丁克祥等用DNA重组技术克隆了hTK基因，表达了hTK融合蛋白。结果显示hTK基因重组入PET28a+的EcoRI和XhoI位点，IPTG可以明显诱导hTK在大肠杆菌中表达13。2 定点突变在生物酶工程中的应用21 定点突变技术酶工程的研究已经发展到分子水平，通过基因操作，已实现了许多酶的克隆和表达。定点突变已经成为研究酶结构与功能的常规手段，并被广泛用于改善酶的性能。定点突变技术可以有目的地在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸。由于突变的定向性、取代残基的可选择性、对高级结构的无(少)干扰性、检验手段的可靠性，与其他技术相比，定点突变技术显得准确而有效14 。目前常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变。根据突变残基在酶结构中所处的位置，定点突变又可分为活性位点残基突变和非活性位点残基突变。定点突变靶目标的选择的依据主要是酶序列的同源性以及其高级结构的特点15。因此，在空间结构信息指导下进行定点突变，往往会取得事半功倍的效果。22 定点突变在酶研究中的应用221 植酸酶的基因工程改良及应用研究前景在我国，植酸酶基因工程的研究虽起步较晚，但已取得了突破性进展。姚斌等(1 998) 16采用异源受体一毕赤酵母(Pichia pastoris)作为生物反应器高效表达了来源于黑曲Aspegillus niger 963的植酸酶基因phyA2。为了能使其在毕赤酵母中高水平表达，首先对其结构基因进行了改造，去掉原 phy A基因中的内含子和信号肽编码序列，在不改变所编码氨基酸的情况下定点突变优化了对此基因在酵母中高效表达起关键作用的精氨酸(Arg)密码子(将使用频率极低的Arg密码子CGG 和CGA突变为酵母中高频使用的密码子AGA)。，植酸酶在重组酵母中得到高效表达和有效分泌，表达产物与天然植酸酶在酶学性质上没有差异，具有正常的生物学活性。目前，通过基因工程微生物发酵来大规模廉价生产饲用植酸酶酶制剂这一问题已经基本得到解决17。通过基因工程手段，还可在分子水平上对饲用植酸酶进行改造，改善其性质，提高其有效性以及使其具备在饲料中使用所需的各种特性，如酶活性、耐热性，对动物胃蛋白酶、胰蛋白酶的抗性等。通过分子生物学与基因工程手段的方法，能够大幅度提高植酸酶的表达量，降低其生产成本；利用基因工程、蛋白质工程等手段，可改善植酸酶的各种理化特性，使其进一步适应饲料加工业的需要。222 定点突变木聚糖酶陈健18等运用PCR介导的定点突变对米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的重组表达进行了研究，获得一表达量远远高于亲本的突变株I156A，对其进行了提纯并研究其酶学特性发现，突变株培养上清液中的酶活单位比亲本提高了约l000倍。两者的Km相差较大。223 突变转氨酶突变转氨酶的某些非活性位点残基会对其活性位点产生间接效应，有利于与底物结合，从而提高酶的催化活性19 20 。Jefery 等测定了EcoliAspAT五种突变酶的晶体结构，发现突变酶的侧链绕 一邸有一定的旋转，导致氢与突变残基以及辅酶质子化的Schif碱连接模式发生变化。这说明活性中心以外的残基对活性中心残基的空间结构以及相互作用有非常重要的影响。Eleonore Kohler等通过将Ec0li AspATs中Va139突变为TyrATs中对应位点Leu，结果发现突变酶对Tyr、Asp和Glu的催化活性显著提高。Shinya Oue21等突变了AATase非活性位点的17个残基，该突变酶对非天然底物Val的催化效率(kcatKm)提高了21 X 106倍。Malashkevich等突变Ecoli AspAT的6个残基，大大提高了突变酶对Tyr的转氨活性，但仍具有对Asp的转氨活性。x射线成像分析了突变酶和抑制剂的复合物，并揭示出底物选择性的结构基础。许多研究结果表明，定点突变在改变转氨酶的底物特异性方面取得了很好的效果22,23。224 其它酶中的应用 杨晟等24以太肠杆菌青霉素G酰化酶的晶体结构为模板用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构。在此基础上将B亚基427位(突变A)和430位(突变B)赖氨酸残基突变为丙舞酸，降低了藩酶的等电点增加了疏水性，从而提高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性 两个突变体与亲车相比比活力和Km相近，最适pH减少了0 5个单位突变B在pH 5 2的溶液中的稳定性明显提高。突变A和B在15DMF中的半衰期分别比亲本酶提高了60 和166。周赞虎等25研究超氧化物歧化酶基因突变在大肠埃希菌中表达得到了；理想效果。许建明等26 对巨噬细胞金属弹力酶基因表达的研究，结果理想。杨涛等27对中国人2型糖尿病合并高甘油三酯血症患者脂蛋白酯酶基因突变分析，发现功能有所提高。3 展望基因重组与定点突变技术可以有效地用于酶的改造。它不仅加深人们对酶的机理及结构与功能关系的认识，而且也为进一步研究该酶的稳定性及底物特异性等方面提供支持。然而，并非所有的生物酶工程技术都能取得预期的结果。究其原因，可能是对酶的结构、功能和作用机制不完全了解，因而得不到所希望的酶。由于某些原因使得通过这种方法得到的酶的耐热性都不高，究其原因有待于研究。但随着计算机技术、化学理论以及蛋白质结构与功能相互关系的研究进展，生物酶工程技术会得到越来越广泛的应用。参考文献1 周顺伍主编 动物生物化学 北京：中国农业出版社，2001年2月3 北京农业大学主编 动物遗传学 北京：中国农业出版社，2002年9月4 李艳，李玉 AmpC酶的研究进展 医学综述 2002，8（l2） 6836855 LohmannR，SoubaWW ，Pg)deBP。et a1Ratliver endothelial cell g1utamine transporterand glutaminase expression contrast withparenchymal cellsAm J Physlo。1 999。276(3Pt1)：G7437506 李义兵，杨俊涛，刘宏鸣 反义GAcDNA重组质粒的构建及其对结肠癌细胞增殖的影响 中华实验外科杂志 2005，22（l）： 1171177 中国科技大学科技实业总公司 基因重组葡萄糖异构酶 院校成果 2003（10）：238 Sumi H，Hamada H，Tsuslma H，et a1A novel fibrinolytic enzylne(nattokirmse)in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybeanfoodinthe Japanese dietExperienfia，1987，43(10)：1110 1ll19 张淑梅，李晶，王玉霞 等纳豆激酶基因工程研究进展 中国生物工程杂志 2004，23（9）： 555810 James Ls，Thomas JKHuman eytesolie thymidine kinaseJJ BioChem，1988；263：375-8211 Fujiwaki R，Hata K，Nakayama K，et 02 Thymidine kimse 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