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细胞凋亡及其调控分子机制 凋亡的概念 与坏死的区别凋亡信号通路细胞凋亡相关蛋白 细胞凋亡与疾病细胞凋亡检测 细胞凋亡名称的由来 英国Aberdeen大学病理系Kerr教授 1972年我和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡方式 联想到秋日落叶 我们就把它称作Apoptosis SydneyBrenner1 3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstituteBerkeley CA USAb 1927 inUnionofSouthAfrica H RobertHorvit1 3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology MIT Cambridge MA USAb 1947 JohnE SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstituteCambridge UnitedKingdomb 1942 THE2002NOBELPRIZEWINNER 王晓东 从事的是细胞凋亡规律的研究 2000年 他和助手们进行了一项实验 研究一种神秘的线粒体蛋白质Smac 这种蛋白质可以打破肿瘤的 坚硬堡垒 诱使肿瘤细胞 自杀 对研究治疗癌症方法有重要帮助 从1996年他建立起自己的研究室后 他的论文成果在8年间被其他科学家引用超过了15000次 第一节细胞凋亡的特征及意义 一 细胞凋亡的基本特征 程序性细胞死亡programmedcelldeath PCD在发育过程中定时出现的生理性刺激诱导的细胞死亡 用于选择性地清除多细胞动物体内一些无用的或危险的细胞 依据形态学不同 程序性细胞死亡可划分为凋亡 apoptosis 自噬 autophagy 肿胀性死亡3种形式 细胞凋亡 apoptosis在生理和病理条件下 由基因控制的自主有序的死亡过程 生理条件下 凋亡用以清除单个细胞 继而由巨噬细胞内吞 最后再由溶酶体执行降解功能 自噬autophagy 是一种在进化上保守的真核细胞内转运泡的运输机制 它可将细胞本身的亚细胞成分如蛋白 胞质或细胞器 通过溶酶体中的水解酶进行消化降解和循环 凋亡和自噬都是细胞内重要的生理过程 坏死Necrosis 各种致病因子 干扰和中和了细胞的正常代谢活动 造成细胞的意外死亡 诱发因素特定的生理病理因素 药物缺氧 药物 毒素组织分布单个细胞分布成片细胞组织反应形成凋亡小体 被周围组织细胞内容物溶解细胞吞噬 无炎症反应释放 有炎症反应 坏死 凋亡 形态学 细胞体积皱缩变圆 细胞浆失水浓缩肿胀 外形不规则化细胞膜保持完整 形成泡状 凋亡破裂后期内陷包裹核物质和细胞器形成凋亡小体细胞核核膜完整 核皱缩 染色质固缩核肿胀破裂 聚集在核膜下 最后核裂成碎片染色质不规则外移细胞器大多数保持完整 线粒体肿胀 多受损 溶通透性增加 释放细胞色素酶体破裂 线粒体肿胀破裂 凋亡 坏死 DNA阶梯状片段化随机断裂磷脂凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻外翻ATP合成并提供能量耗竭 凋亡 坏死 生物化学 出现180 200bp大小及其倍数的核苷酸片段 DNALADDER 细胞坏死与凋亡的形态区别 细胞凋亡的诱发因素 细胞凋亡的生理意义 1 确保正常发育 生长 根据代谢需要调节细胞数量 保持成体器官正常体积 如 指 趾 间隙的形成2 维持内环境稳定如 清除受损 突变或衰老的细胞3 防御功能如 使受到病毒感染的细胞凋亡 第二节细胞凋亡的发生机制 一 凋亡相关基因 一 ced基因线虫 c elegans 1090个体细胞 其中131个细胞在发育过程中产生凋亡 发现14个基因与凋亡有关 且虫体透明 易于观察 细胞内与凋亡有关的基因分2类 1 存活基因 ced 9 bcl 2蛋白家族2 致死基因 ced 4 凋亡蛋白酶活化因子Apaf 1 apoptosisproteaseactivatingfactor 1 3 致死基因 ced 3 Caspase家族 cycteinylaspartate specificprotease 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 线虫 人类 Caspase 1996年Alnemri等统一命名的一类与ICE Ced 3同源性半胱氨酸蛋白酶 二 caspase与细胞凋亡 1 特点 1 是一种Cys蛋白酶 2 底物Asp X 3 以酶原形式存在 4 活化的Caspase特异性水解一套底物 导致不可逆的细胞凋亡 5 细胞内有Caspase抑制剂 IAP inhibitorsofapoptosisproteins 2 结构特征 以无活性的形式存在 在Pro Caspases的N端均含有一段的前区域 Prodomain 活性形式均是由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体 一分子Pro Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基 大亚基的C端含有活性中心 其中半胱氨酸 C 是必需氨基酸 故属于半胱氨酸蛋白酶类 3 分类 14种 1 细胞因子前体 caspase1 4 5 11 12 13 14不是凋亡的直接效应分子 2 凋亡起始分子 caspase2 8 9 10 3 凋亡效应分子 caspase3 6 7参与介导细胞凋亡 ICE家族成员A 3类caspase 蓝色参与炎症反应 红色为执行者 绿色为启动者 B caspase 3的结构模型 C caspase 3的活化过程 执行者 启动者 4 caspase活化 Caspase酶原有很低的活性若caspase过表达 酶原在高浓度下可自身活化Caspase8 9含有死亡效应域 deatheffectdomain DED 可相互作用 使酶原自身活化 Caspase8 激活所有酶原 如 Caspase3 6 7 9Caspase9 活化需线粒体释放CytC 活化后激活Caspase2 3 6 8 10 Caspase3 6 7 效应Caspase 5 Caspase作用 1 灭活细胞凋亡抑制蛋白 鼠 Caspase活化的DNA酶 Caspaseactivateddeoxyribonuclease CAD 细胞凋亡抑制物 inhibitorofCAD ICADICAD与CAD结合 CAD无活性 Caspase剪切ICAD ICAD失活 CAD活化 CAD游离 进入细胞核内降解DNA 人 Helacell DFF DNAfragmentfactor 与ICAD同源 Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶 多聚 ADP 核糖聚合酶 polyADP ribosepolymerase PARP 抑制Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶 与基因完整性的监护有关 PARP降解 Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶活性增加 裂解核小体间的DNA 导致细胞凋亡 Caspase 2 降解细胞结构蛋白 降解核纤层蛋白 肌动蛋白 核分裂相关蛋白 3 切割细胞效应蛋白 4 降解其他的caspases 6 Caspase活化抑制剂IAP inhibitorsofapoptosisproteins细胞内存在的Caspase抑制蛋白 IAPinhibitorsofapoptosisproteins家族 阻止细胞凋亡过程 二 细胞凋亡的诱导发生细胞凋亡的信号传递 1 Fas介导细胞凋亡 2 细胞色素C介导的细胞凋亡 3 粒酶GrB诱导细胞凋亡 1 2 DR 死亡受体deathreceptors DR含DD 死亡结构域 deathdomain DD DD存在于DR之胞内区 和FADD蛋白中 FADD蛋白 Fas相关的死亡结构域 Fas associateddeathdomain FADD蛋白含有DD DED 可与pro caspase8结合 DED 死亡效应结构域 deatheffecterdomain DED 存在于FADD蛋白 一些起始caspase酶原如pro caspase8中 1 死亡受体介导的细胞凋亡 外源性的 Fas 细胞表面受体 跨膜蛋白 共4个蛋白 1 FasLigand FasL 是Fas的天然配体 两者介导细胞凋亡 FasL主要在淋巴细胞膜上表达 2 FasFas Apo 1存在于细胞表面的特定区域 一旦被FasL或Fas抗体激活 可将信号传递到细胞内 Fas属肿瘤坏死因子受体 TNFR 及神经生长因子受体 NGFR 超家族 是细胞凋亡的受体信号 又叫死亡分子 Fas Apo 1 CD95 Fas从人KT3细胞株分离的cDNA克隆 Apo 1从人SKW6 4细胞株分离的cDNA克隆 后来证明两者完全一致 命名为Fas Apo 1 或称CD95 Fas蛋白位于10q33 编码335AA 成熟319AA 是跨膜蛋白 由胞外区 跨膜区 胞内区组成 胞内区有80AA 称死亡结构域 deathdomain DD 3 FADD蛋白 Fas相关死亡结构域蛋白 Fas associateddeathdomainprotein包括 DD 死亡结构域deathdomainDED 死亡效应结构域deatheffectdomain Deathinducingsignalcomples DISC FasL与Fas结合 同三聚体 Fas的DD成簇 与FADD蛋白结合 FADD蛋白活化Caspase8活化Caspase3 6 7活化细胞凋亡 1 Fas介导细胞凋亡 死亡诱导信号复合物Deathinducingsignalcomplex DISC 诱导因素 跨膜电位 m PTP开放 通透性转换孔 凋亡启动因子 细胞色素C smac AIF 释出AIF 凋亡诱导因子 2 线粒体相关的细胞凋亡途径 内源性的 现在 提得最多的 比较公认的线粒体在凋亡中的作用有两点 1 细胞色素C的释放 2 Smac Diablo的释放 2 细胞色素C介导的细胞凋亡 CytC释放入胞质与胞浆接头蛋白Apaf 1结合Apaf 1寡聚化 募集Caspase9原Caspase9活化Caspase2 3 6 8 10活化细胞凋亡 凋亡蛋白酶激活因子1 Apoptoticproteaseactivatingfactor 1 Caspaserecuitmentdomain 5Fas介导细胞凋亡 Caspase8活化 凋亡诱导因子 凋亡蛋白酶激活因子 线粒体仍有足够的CytC 及其他细胞色素 呼吸链完整 产生ATP 保证Caspase活化 细胞凋亡 CytC释放过多 呼吸链破坏 氧消耗 但是不产生ATP 导致细胞坏死 细胞含有caspase抑制剂 不能导致caspase依赖的细胞凋亡 当线粒体巨通道破坏 CytC释放 AKtJNKp53 Bcl 2 3 粒酶的基本结构和功能定义 粒酶 Granzyme Gr 是CTL和NK细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称 以酶原形式存在 分类 GrA GrB GrH GrM 类胰蛋白酶2功能 酶切靶细胞的多种底物蛋白 启动细胞凋亡 GrB活性最高 与其他粒酶 穿孔素 PEN Perforin 一起储存在CTL的杀伤颗粒中 粒酶进入靶细胞 CTL识别靶细胞 杀伤性颗粒移向靶细胞一极 极化 GrB PEN等蛋白释放入细胞间隙穿孔素 PEN 协助GrB进入靶细胞 定位在胞浆和胞核 CTL 肿瘤细胞 CTL正在诱导肿瘤细胞凋亡 GrB诱导细胞凋亡 1 Caspase依赖途径 GrB切割Caspase10Caspase3 7 PARP 多聚ADP核糖聚合酶 Bid DNA片段化因子 DFF 细胞凋亡GrB确保靶细胞即使缺失1种或几种Caspase成员时 仍能走向凋亡 切割DFF 使CAD游离 降解DNA结构蛋白Filamin 使细胞骨架破坏PARP 使Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶活性增加 裂解核小体间的DNA细胞凋亡 GrB DFF DNA片段化因子CAD caspase活化DNA酶PARP 多聚ADP 核糖聚合酶 人 Helacell DFF DNAfragmentfactor 与ICAD同源 2 GrB介导线粒体凋亡途径 GrB切割胞浆Bid 产生活化Bid tBid tBid移至线粒体 募集Bax 诱导线粒体释放CytC Smac等因子 细胞凋亡 诱导线粒体开启膜通透性孔道PTP 破坏线粒体内膜电位 损伤线粒体功能 导致细胞死亡 第三节细胞凋亡的调控 细胞自身蛋白的调控作用 一 P53 二 Bcl 2家族蛋白 三 c myc 四 IAP家族蛋白 细胞凋亡的相关调控基因 抑制凋亡基因 Bcl 2 IAPs促进凋亡基因 Fas Bax P53 双向调控基因 c myc 一 P53 野生型的P53蛋白是一种包含393AA的转录因子 活性形式为四聚体 自N端起依次包括转录活化区 DNA结合区 四聚体化区 C端调节区 1 P53表达细胞中的DNA损伤 纺锤丝断裂 癌基因异常激活 缺氧 ATP储备下降等信号都能导致p53表达增加 已发现有数十种p53的相互作用蛋白 P53在胞浆中的含量受到严密的监控 2 P53对细胞周期和凋亡的调节 1 抑制细胞周期p53主要作用于细胞周期的G1 S期 G2 M期等检查点 并引起细胞周期停滞于G1或G2期 p53通过促进p21的表达 抑制如cyclinD CDK4 cyclinE CDK2等的活性 引起细胞周期阻滞于G1期 细胞周期负调节因子14 3 3sigma是p53下游靶基因之一 主要通过调节细胞周期的G2 M检查点引起G2期阻滞 且与p21有相互增强作用 2 促进细胞凋亡 细胞周期在G1 G2 M期的停滞为细胞DNA修复提供了时间 一旦修复失败 p53则在其他因素作用下 有效诱导细胞凋亡 P53促进一系列细胞凋亡的相关分子的表达如Fas DR5 Bax Apaf 1 Noxa PUMA等 增加细胞对凋亡信号的敏感性 P53 molecularpoliceman 二 Bcl 2家族蛋白的调控作用 1 Bcl 2家族的结构Bcl 2Bcelllymphoma leukemia 2两个结构域 羧基端的跨膜结构域Bcl 2同源结构域 Bcl 2homology BH Bcl 2 229aa构成 分布在线粒体内膜 细胞内膜表面 内质网 核膜等处Bcl 2和C elegans中的ced 9有很高的同源性 具有促进细胞存活的功能Bcl 2的功能是延长细胞的寿命 而不是刺激细胞的增殖 Bcl 2家族分子结构 2 BcL 2的同源基因和蛋白质 抗凋亡作用 促凋亡作用 有Bax Bak BH3onlyprotein BcL 2基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力 BcL 2家族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡 Bcl 2 Bax Bcl xs对凋亡的作用 因此 Bcl 2表达增加 并不一定抑制凋亡 1 Bax Bax形成二聚体 诱导凋亡 2 Bcl 2 Bax二聚体更稳定 Bcl 2增加 Bcl 2 Bax增加 Bax Bax减少 抗凋亡 3 Bcl xs存在 与Bcl 2形成二聚体 Bcl 2 Bax减少 Bax Bax增加 诱导凋亡 3 Bcl 2抗凋亡机制 直接的抗氧化 抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质 抑制促凋亡的Bax Bak的作用 抑制Caspases激活 维持细胞钙稳态 三 c myc 8q24 编码产物p62 在核内 具有转录因子活性 调节基因转录 功能 促进细胞增殖 c myc低水平时 细胞生长停滞 c myc表达 血清生长因子存在时 促进细胞增殖 c myc表达 血清生长因子不存在时 促进细胞凋亡 几乎所有肿瘤都有c myc基因的异常表达 高表达 四 IAP家族蛋白 IAP inhibitorofapoptosisproteins 家族蛋白是细胞凋亡抑制蛋白家族 已发现8个IAP家族成员 NIAP cIAP 1 cIAP 2 XIAP survivin BRUCE livin ILP 2 1 IAP直接抑制Caspase途径的caspase3 7 9的活性 如在Fas caspase8途径中 IAP抑制caspase3活性而发挥抑制 在CytC Apaf 1途径中 XIAP直接与caspase9酶原结合 抑制caspase9活化 又结合caspase3 抑制caspase3作用 2 作用于TNFR介导的信号传导通路 抑制细胞凋亡 作用 第五节细胞凋亡与疾病 细胞增殖过快及凋亡过少均在肿瘤的发生中起了重要作用 P53突变 Bcl 2的高表达在许多肿瘤中都存在 CarcinogensMutatep53 BladderBloodBrainBreastColonEsophagusLiverLungSpleenThyroid CancerTypes ChemicalsVirusesRadiation Mutate 正常机体细胞生长与死亡的平衡 生长 坏死 凋亡 正常机体 细胞凋亡与疾病 凋亡相对不足 肿瘤 自身免疫性疾病 病毒感染等 肿瘤肿瘤的重要发病机制 细胞增殖过度细胞凋亡受抑 死亡不足病变组织内细胞存活 死亡 肿瘤细胞数目的净增长加大可能机制 Bcl 2高表达 IAPs高表达 P53基因突变从发病学上 细胞凋亡实际是机体天然的抗癌机制之一 细胞凋亡过度 神经退行性疾病 造血衰竭性疾病 心肌缺血 再灌注损伤 心血管疾病心肌缺血 缺血 再灌伤所致心肌细胞死亡 坏死和凋亡可能机制 氧化应激 钙超载 p53基因激活心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少也可能是心力衰竭发生 发展的主要原因之一 细胞凋亡过度 第四节细胞凋亡的检测方法 一 形态学检测 一 HE染色 二 透射电镜观察 三 荧光显微镜观察 透射电镜观察 凋亡早期 染色体核边集 在核膜周围边聚形成新月体形 随之染色体发生固缩 呈电子密度增强 核形不规则 核膜表面凹凸不平 核发生碎裂 细胞体积变小 细胞浆浓缩 其内的细胞器保存较好 或轻度增生 线粒体数目轻度增加和轻度肿胀 细胞浆可见空泡增多 细胞膜保持完整 细胞膜表面微茸毛和伪足减少或消失 凋亡晚期 可见膜包裹内有较完整细胞器和细胞核碎片的凋亡小体 apoptosis 概述 荧光显微镜观察fluorescentmicroscope Hoechst33258 Hoechst33342 均为DNA特异性染料 与AT键结合 在pH2 0时优先与RNA结合 染色DNA时应调pH7 0 染料不溶于磷酸缓冲液 所以配制时先必须用蒸馏水溶解 4 避光保存 染料对死细胞或70 冷乙醇处理的细胞可立即染色 对活细胞的染色是渐进的 在10min内可达到饱和 二 生化检测 一 琼脂糖凝胶电泳 二 原位末端标记技术 一 琼脂糖凝胶电泳 原理 染色体从核小体间断裂 为180 200bp或其倍数组成的寡核苷酸片段 通过提取DNA 电泳 UV下 可见DNALadder 观察 凋亡细胞Ladder坏死细胞Smear 操作 收集细胞 PBS洗涤细胞裂解液酚抽提氯仿异戊醇抽提无水乙醇沉淀TE溶解电泳观察 观察 凋亡细胞Ladder坏死细胞Smear 二 原位末端标记技术 原位末端标记是 将渗入到凋亡细胞的外源性核苷酸 生物素标或荧光标 在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下 与断裂的ssDNA或dsDNA聚合 再通过显色系统显示 通常的方法是 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling 称TUNEL 常用的标记和显色系统 生物素标记的dUTP地高辛标记的dUTP荧光素标记的dUTP显色系统 辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体和DAB 辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和DAB 荧光素标记的dUTP FITC dUTP 流式细胞仪或荧光显微镜观察 该技术不能区分凋亡 坏死 自溶性死亡的细胞 必须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断 凋亡细胞成单个或少数几个孤立地分布在组织中 具有凋亡细胞的核特征 核固缩 显一个或多个染色体团块 或凋亡小体 周围或局部无炎症反应 三 流式细胞仪检测flowcytometer 一 PI单染 二 Hoechst33342 PI双染色 三 Annexin PI双染色 流式细胞仪flowcytometer荧光激活细胞分类器fluorescentactivatedcellsorter FACS Hoechst33342是双苯并咪唑家族成员 能特异性与DNA螺旋小沟中AT结合 它能被活细胞摄入 也能在摄入后被细胞排出 活细胞对碘化丙锭 PI 溴化乙锭 EB 有拒染性 当细胞被这些染料着染 提示为晚期凋亡或坏死 一 PI单染 细胞凋亡之初 由于核酸内切酶的激活 将DNA从核小体间切断 产生游离寡核苷酸片段 这些片段弥散到胞浆中 但是细胞膜完整 不能离开细胞 乙醇固定 PBS洗涤 使细胞膜通透性增加 并从细胞浆弥散出胞外 但是大分子DNA在胞内 不能被抽提 坏死细胞中 DNA可染性并不立即下降 甚至反而增加 可能是由于细胞坏死时部分DNA变性 引起更多的可染位点 原理 收集细胞 PBS洗涤冷70 乙醇固定12h以上离心 PBS洗涤 400目筛网过滤PI 含RNase 染色流式细胞仪检测 操作 判断 在直方图上 Go G1期前有一个亚二倍体峰 检测晚期凋亡 但不能判断是晚期凋亡还是坏死 PI单染检测细胞周期改变 细胞周期分析 二 Hoechst33342 PI双染色染料配制 Hoechst33342 配10ug ml 4 避光保存 PI 5ug ml 4 避光保存 原理 凋亡细胞膜在早期是完整的 但细胞膜的通透性已有增加 因此进入早期凋亡细胞的Hoechst比正常细胞多 而EB PI等不能进入凋亡细胞 即正常细胞不经固定 对EB PI是拒染的 而坏死细胞早期就被破坏 能被这些染料染色 操作 悬浮细胞 Hoechst33342 终浓度1ug ml 贴壁细胞消化后 培养液重悬 加Hoechst 37 7 10min 离心 洗涤 加PI 4 避光15min 400目滤网过滤 流式细胞仪检测 结