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微生物基因组学 1 第一部分微生物基因组学的发展历史和意义 1 基因组和基因组学的定义 2 从DNA双螺旋到微生物基因组 3 微生物基因组计划概况和重要意义 4 几种重要微生物基因组的测序 5 微生物基因组学网络资源介绍 教学内容 第二部分微生物基因组的测序与注释 1 微生物基因组的测序 2 微生物基因组的注释 2 第三部分微生物基因组学的应用 1 原核生物基因组概述 2 从微生物基因组学研究基因的进化 3 微生物基因组的其它应用 3 一 基因组和基因组学的定义 4 基因组是一个相互作用的整体 基因组不仅仅是单个起作用的基因的集合 它还对何时 何地产生这些组分的信息进行整合 比如细菌芽孢的形成 就需要一整套基因高度协调的表达 需要复杂的基因间相互作用的模式来组织合适的反应 因此 基因组包含着对信息的全局性 高度协同的控制 以执行一系列细胞功能 了解一个有机体的全部生物学的先决条件是确定它的完整的基因组序列 J CraigVenter FounderandChairmanofTIGR 5 什么是 基因组学 基因组学 genomics 来源于 genome 这个词 是一门对生命有机体全基因组序列进行分析 比较和注释的新兴学科 基因组 genome 序列为我们提供了有机体的最基本信息 序列中的基因和调控位点就是该有机体的 零部件 和 运行指令 同时它还提供该有机体进化方面的线索 序列就自然而然地成为研究诸多新物种的出发点 基因组学是二十世纪医学和生物学飞跃发展中最激动人心的成果之一 并将为二十一世纪的医学和生物学打下了坚实的基础 6 基因组学的定义 基因组一词是1920年由Winkler引入学术界的 它由基因 GENe 和染色体 chromosOME 两个词组合而成 代表完整的单套染色体和基因 1986年 JacksonLaboratories的TomRoderick提议用它来命名旨在研究全基因组序列及与之相关高通量 high throughput 技术的新兴学科 1987年 VictorMckusick和FrankRuddle一起创办了 genomics 杂志 这是第一次 genomics 这个词在科学界得到广泛的应用 7 基因组学领域包括DNA测序 在物种内进行基因组多样性的采集以及基因转录调控的研究 即基因组学覆盖了从DNA序列分析到研究生物体对环境干扰的响应这样比较广的范围 到1990年 E coli 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonellatyphimurium 和枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis 的遗传图谱已相当详细 包括成百上千个定位基因 靠这些图谱几乎可以诞生低精确度的比较基因组学了 1990S中期 对上述细菌的基因组进行了全序列测定 标志着基因组学时代的到来 8 Genomicsisthestudyofthemolecularorganiza tionofgenomes theirinformationcontent andthegeneproductstheyencode Prescott Harley Klein Microbiology FifthEdition 9 随着基因组和基因组学这两个术语变得流行起来 一系列新的术语也被创造出来 每个新的研究领域都冠以 组学 omic 的名称 而被研究的对象则被称为 组 ome 例如蛋白质组和蛋白质组学 一个蛋白质组 proteome 表示某个时刻在一个细胞或生物体中全部的蛋白质组成 其它类似的词还有转录组 代谢组 糖组和变异组 这些新兴的领域能否归到 基因组学 之下 尚有较大的争议 关于基因组学的范畴 10 Genomicsisabroaddiscipline whichmaybedi videdintoatleastthreegeneralareas 1 Structuralgenomics isthestudyofthephysicalnatureofgenomes ItsprimarygoalistodetermineandanalyzetheDNAsequenceofthegenome 2 Functionalgenomics isconcernedwiththewayinwhichthegenomefunctions Itexaminesthetranscriptsproducedbythegenomeandthearrayofproteinstheyencode 3 Comparativegenomics genomesfromdifferentorganismsarecomparedtolookforsignificantdifferencesandsimilarities Thishelpsidentifyimportant conservedportionsofthegenomeanddiscernpatternsinfunctionandregulation Thedataalsoprovidemuchinformationaboutmicrobialevolution particularlywithrespecttophenomenasuchashorizontalgenetransfer 11 基因组学研究的3大主题和6个层面 12 基因组学带来研究问题的新视角 新技术的出现伴随着全新的问题以及人类认识生命的新途径 许多年来 分子生物学方法一直作为一个 还原论 的工具 被用来剖析细胞 理解细胞中各个部分的独立工作方式 基因组学的研究领域则提出了 综合论 的研究方法 实际上 今天的分子生物学主要是由基因组测序和功能分析推动的 目的是理解细胞各个部分如何协同工作 一个正在行使功能的基因组是如何响应环境变化的 体内哪些蛋白质发生着相互作用 这些问题带来了对生命现象的新认识 13 直接获取基因进行研究工作 通过与已测序基因的比较 预测新基因的功能与在代谢中的可能作用分析 通过分析相关基因活性帮助建立细胞中完整的代谢网络 疾病诊断与预测 疫苗与药物的开发 基因进化 乃至物种进化的分析 基因组学提供众多学科全新的起点 14 二 从DNA双螺旋到微生物基因组 15 基因组学发展的历史 基因组时代的奠基石 DNA双螺旋结构的提出Sanger双脱氧末端终止法测序和DNA自动测序仪的发明PCR技术生物信息学软硬件设施的发展 16 17 一 近代分子生物学理论与技术的发展1940S 1970S理论上的三大发现 1 DNA是遗传物质 2 DNA的双螺旋结构 3 遗传信息的传递方式技术上的三大发明 1 限制性核酸内切酶 2 载体技术 i e YAC 3 逆转录酶 18 JamesWatsonandFrancisCrick 19 Nature 1953Apr25 171 4356 737 738Molecularstructureofnucleicacids astructurefordeoxyribosenucleicacid WATSONJD CRICKFHNature 1953May30 171 4361 964 967Geneticalimplicationsofthestructureofdeoxy ribonucleicacid WATSONJD CRICKFHNature 1953Apr25 171 4356 738 740Molecularstructureofdeoxyribonucleicacid WILKINSMH STOKESAR WILSONHR 20 21 1962年 2000年 22 Theprecisesequenceofthebasesisthecodewhichcarriesthegeneticinformation 碱基的排列顺序就是携带遗传信息的密码 23 基因是迄今为止最为复杂的程序 BillGates 24 二 DNA测序技术的诞生与发展1975 FrederickSanger双脱氧链终止法 1977 Maxam和Gilbert氧化法 1976年 在英国的Gordon会议上两个小组同时宣布 但Maxam和Gilbert直到1980年才正式发表研究结果 1958 1990 1991 1999 25 StructureofInsulin 26 1977 Sanger及其同事改进了双脱氧法 在一块4泳道超薄胶上1次可以读出几百个碱基序列 1977 Sanger研究组完成了第一个全基因组 X174噬菌体基因组 5386bps 测序 1982 该室又完成了 噬菌体基因组 48502bps 测序 这是当时最大的测序工程 而同时期 Maxam和Gilbert的化学法不如Sanger及其同事的酶法简便 很快就被淘汰了 1985年 加州理工学院 CIT Hood和Smith用四种荧光染料标记DNA的方法 从而建立了用自动激光仪读取测序胶的结果 27 TheSangerMethodforDNASequencing 28 1986年6月 第一台自动DNA测序仪在CIT诞生 1987年底 美国AppliedBiosystemsInc 采用Hood的技术开发了第一台市售的自动测序仪 每台仪器每天可以测一万到两万个碱基粗序列 rawsequence 近年来 自动毛细管电泳测序仪 Fullyautomatedcapillaryelectrophoresissequencer 如ABIPrism3700 每台仪器每天可以测出五十万个碱基粗序列 29 ABIPrism3700DNASequencer ABIPrism377DNASequencer Price 25 000Euro25 000 DNA序列分析实验室 30 10101010101010010101010100110101010101010010101010100101001110000111000001110000011000101010101010010101010101010100101010101001010011100001110000011100000110001001010101001010101010101010010101010100101001110000111000001110000011000101010101010010101010101010100101010101001010011100001110000011101001110000111000001110000011000101010101010010101010101010100101010101001010011100001110000011100000110001001010101001010101010101010010101010100101001110000111000001110000011000101010101010010101010101010100101010101001010011100001110000011100000110001010101010100101010101010101001010101010010100111000011100000111000001100010101010101001010101010101010010101010100101001110000111000001110000110001010110000111000001110000011000101010101010010101010101010100010101010101001010101010100010101010101001010101010101010010101010100101001110000111000001110000110001010110000111000001110000011000101010101010010101010101010111001011001010101010101010101010100010111010100000000001011100000010001000001010101001010100110010101010010010100100101001010100100101001000010101001010101010101010101010010000001010100100101001010010100100101001001010000010101010 SequenceAbridgebetweenlifescienceandinformationscience 31 NobiologycouldbedonewithoutGenbank 32 1977年5 3kb的 X174噬菌体基因组完成测序 1990年230kb的人巨细胞病毒全基因组完成测序 1995年1 8M的流感嗜血杆菌基因组完成测序 1996年完成全长为12Mb酿酒酵母基因组的测序 2005年4月229CompleteMicrobialGenomeshavebeenpublished 三 微生物基因组计划 MGP 的实施 33 四 人类基因组计划 HGP 的实施1986年3月 美国能源部健康与环境研究办公室 OfficeofHealthandEnvironmentalResearch 的CharlesDeLisi和DavidSmith在新墨西哥州圣菲市主持召开了一次会议 与会的30多名科学家讨论了测定人类基因组的可行性 并讨论了各种策略 包括酵母人工染色体 噬菌体和粘粒图谱 cosmidmap 随机鸟枪测序 randomshotgunsequencing和cDNA等 大多数人主张用图谱 用大量酵母人工染色体和粘粒克隆来交叠覆盖人类基因组 然后再对单个克隆测序 依此估计 每完成一个碱基要花费1美元 整个项目需要30亿美元 34 1986年诺贝尔奖获得者R Dulbecco提出人类基因组计划 测出人类全套基因组的DNA碱基序列 3X109bp 1988 美国国家研究委员会 NationalResearchCouncil 开始支持人类基因组计划 并每年投资2亿美元 1988 美国国立卫生院 NationalInstituteofHealth NIH 从能源部手中抢走了领导权 开始领导负责人类基因组计划 由国立卫生研究院和能源部共同组成 人类基因组研究所 NHGIR 1990 美国政府决定正式启动HGP 预计用15年时间 投入30亿美元 完成HGP逐渐地 HGP扩展为多国协作计划 参与者包括 欧共体 日本 加拿大 俄罗斯 巴西 印度和中国等国的科学家 35 36 Science 2001 291 1304 1351 Nature 2001 409 860 921 37 Thegenomiceraisnowareality F Collins DirectoroftheNationalHumanGenomeResearchInstitute NHGRI atNIH 38 Nature 2003 422 835 847 39 三 微生物基因组计划概况和重要意义 40 举世瞩目的人类基因组计划 HGP 人所共知 那么微生物基因组计划 MGP 呢 41 微生物基因组相对较小 易于操作 它的研究比人类基因组计划先行一步 起到了 开路先锋 的作用微生物基因组学所取得的理论和技术进展 为人类基因组计划提供了及有益的借鉴微生物基因组计划的发展 可以为研究人类未知基因的功能提供宝贵的线索一些模式生物 如大肠杆菌和酿酒酵母菌 本身就是人类基因组计划的研究内容人类基因组计划的强大资金投入和在人类基因组计划中发展和完善起来的生物信息学技术又极大地促进了微生物计划的飞速发展由于微生物种类的多样性 可以估计 人类在微生物基因组的总测序量将会超过人类基因组计划 两者的发展相互交融 密不可分 42 1994年 美国DOE Departmentofenergy 启动MGP MGP是对人类基因计划的延续 该计划主要是对环境或能源相关 系统发生学相关 或具有潜在商业应用性的微生物基因组进行完全测序 目的是为了更好的了解地球上的微生物资源 截至2003年4月 MGP已完成约100株微生物基因组的测序 它的研究计划还包括和应用微生物学相关的生物技术 如纤维素降解 碳吸收等等 微生物基因组计划 MGP 43 44 除了美国DOE的MGP 美国的NIH NationalInstitutesofHealth 也资助了很多病原微生物基因组的测序 如第一个测序的细胞生物流感嗜血杆菌 H influenzae 等 它是在TIGR TheInstituteforGenomeResearch 中心测序完成 截至2002年9月 美国的NIAID TheNationalInstitutesofAllergyandInfectiousDisease 资助完成了15个病原菌的测序 另外44个基因组项目也在进行之中 其它资助微生物基因组测序的机构 美国国立卫生研究院 NationalInstitutesofHealth 45 其它资助微生物基因组测序的机构 英国的WellcomeTrust是世界上最大的慈善团体 它的资产达到了150亿英镑 由它资助的SangerInstitute是除了美国之外世界上最大的基因组中心 在HGP中承担了1 3的测序任务 SangerInstitute 现为 TheWellcomeTrustSangerInstitute 的微生物基因组测序主要集中在病原菌和模式生物上 截至2002年9月 它已经发表了7个微生物基因组的序列 同时还有7个已经完成 另外24个还在进行之中 46 1995 2002年原核生物全基因组测序情况 Genomessequencedbetween1995and2002 47 48 2004年9月 49 2005年4月 50 2004年9月 51 2005年4月 52 测序微生物的类别 几乎所有类别的病毒模式微生物极端环境微生物病原原核生物环境降解微生物其他 Viruses 53 病原菌菌株数基因组大小 Mb 炭疽芽孢杆菌 B anthracis 45 23 5 50葡萄球菌 S epidermidis S aureus 62 50 2 90肺炎链球菌 S pneumoniae 22 04 2 16化脓性链球菌 S pyogenes 51 85 1 90脑膜炎奈瑟菌 N meningitidis 22 18 2 27志贺氏菌 S flexneri 24 60 4 83沙门氏菌 S typhietal 34 79 5 13霍乱弧菌 V cholerae 14 0创伤弧菌 V vulnificus 15 13 5 26 测序的部分病原原核生物 54 流感嗜血杆菌 H influenzae 11 83空肠弯曲菌 C jejuni 11 64幽门螺杆菌 H pylori 21 64 1 66鼠疫耶氏菌 Y pestis 34 60 4 83布鲁氏菌 B melitensis 23 29 3 31绿脓假单胞菌 P aeruginosa 16 26巴斯德氏菌 P multocida 12 25产单核细胞李斯特氏菌 L monocytogenes 12 94结核分枝杆菌 M tuberculosis 34 40 4 41 55 麻风分枝杆菌 M leprae 13 27伯氏疏螺旋体 B burgdorferi 11 23苍白密螺旋体 T pallidum 11 14衣原体 Chlamydia 61 04 1 23枝原体 Mycoplasma 60 58 1 35立克次氏体 Rickettsia 31 11 1 25厌氧芽孢梭菌22 80 3 03 C tetani C perfringens Lymedisease B burgdorferi 56 随着新千年的来临 分子生物学的主要目标就是获得尽可能多生物的全基因组序列 全世界已经完成和正在进行的基因组测序项目已经有四百多个 为什么所有这些活动都集中在基因组序列上 微生物基因组学又有些什么重要意义 微生物基因组学的重要意义 57 无论对分子生物学和遗传学持续发展 还是对被称为分子生命科学 molecularlifescience 的生物化学 细胞生物学和生理学领域的发展 基因组序列都是至关重要的 即使最初许多基因的功能未知 一个描述基因组中每个基因序列的目录还是很有价值的 这个目录中不仅包括每一个基因编码区的序列 并且还包括这些基因的调控序列 因此 基因组序列就为全面了解细胞的分子活动打开了一条通道 同时也指出了这些活动的调控方式 58 利用微生物基因组学的知识 我们可以将微生物的全部DNA和蛋白质序列 mRNA和蛋白质水平的变化以及蛋白质的相互作用的所有信息进行整合 以便了解基因组的组织和生命细胞的工作 如果我们有了足够的知识 就可以最终在计算机上模拟一个微生物细胞并预示它对环境的变化将如何应答 59 通过比较广泛的基因组 我们可研究水平基因转移的性质和微生物进化的过程 比较基因组学将有助于微生物生物多样性的研究 病原体的基因组研究可用来洞察病因 并为感染疾病提出治疗方案 提供更敏感的诊断试验 新的抗体和不同的疫苗 能够鉴定可能的毒性基因并研究在感染期间基因的表达 还可以检测宿主对致病因子的反应 60 微生物基因组学在工业上的应用也是巨大的 例如 微生物基因组学能够用来鉴定具有工业潜力的新酶 提高危险废物的生物整治 改良微生物产甲烷和其它燃料的技术 61 微生物基因组学也将极大地影响农业 它可以用来发现新的生物杀虫剂和通过提高诸如固氮这样的过程来改善可持续的农业发展 62 对于所有研究微生物基因的分子生物学家来说 当目标生物的基因组序列未知时 基因也可以从基因组中分离出来 但是这个过程既耗时又费力 并且分离每一个基因都要设计不同的方案 如果基因组序列已知的话 那么所需基因的分离就变得相对容易些 那时基因就可以很简单地从目录上解读出来了 这样基因组学就为分子生物学提供了从序列到表型的新的工作模式 63 对于某些难以在实验室条件下培养的微生物 例如某些古细菌或寄生菌 用普通的实验方法难以对它们进行研究 这时对它们进行基因组测序 并用比较基因组学的方法对其基因组进行注释 是获得有关这些微生物的生物学知识的较好途径 64 最后 进行基因组计划还有一个理由 这项工作将现有技术发挥到了极至 因此基因组测序代表了分子生物学的前沿 该领域在几年前还是不可企及的 现在也还需要创新和大量的艰苦工作才能完成 科学家们一直在努力完成这项几不可能的工作 众多分子生物学家参与基因组计划的动机十分简单 那就是向未知挑战 65 基因组学回答有趣的问题示例一 研究人类病原体的最大困难之一是梅毒的致病因子 苍白密螺旋体 T pallidum 这是因为我们不能在人体之外培养T pallidum 因此 有关它的代谢或它逃避宿主防御的途径也就几乎不知道 更没有相关疫苗的产生 那么很自然 它的基因组的测序带来了相当大的兴奋和希望 66 根据T pallidum基因组注释绘制的代谢图 67 结果表明 T pallidum的代谢途径是残缺不全的 它能够用碳水化合物作为能源 但是缺乏TCA循环和呼吸电子转移 它也缺乏许多生物合成途径 例如酶辅助因子 脂肪酸 核甘酸 必须依赖于它的宿主来提供 因为缺少几个关键的途径 所以该病原体不能在体外培养的原因也就昭然若揭了 T pallidum具有许多具有重复序列特征的表面蛋白基因家族 据推测 这些基因可能是通过重组来产生新的表面蛋白 并使该菌逃避宿主免疫系统的攻击 我们有可能通过这些表面蛋白来鉴定T pallidum菌株 还可以用来制备梅毒疫苗 由于T pallidum基因组中约有40 的基因未知功能 其中一些可能是负责产生毒素及其它毒性因子的 如果我们要对T pallidum是任何引起梅毒有更多的了解 就需要对这些基因进行更进一步的研究 68 基因组学回答有趣的问题示例二 衣原体 Chlamydiae 是非运动的球形G 细菌 它只能在真核细胞细胞质的泡囊中以独特的生命周期进行繁殖 它的基因组测序已经揭示了几个惊人的结果 因为该菌的生命周期非常特别 人们曾预期它的基因组可能也很特殊 但事实并非如此 它的基因组于其它许多细菌基本都是一样的 69 微生物学家称Chlamydiae为 能量寄生菌 认为它从寄主细胞中获得所有的ATP 但基因组结果表明 它至少有一些自己制造ATP的基因 Chlamydiae基因组中含有20个从真核宿主细胞中获得的基因 其中一些基因是类似植物的 那么我们有可能推测 Chlamydiae起初是感染了植物宿主 然后才转移至动物 另一个让人惊奇的发现是Chlamydiae具有合成肽聚糖的基因 因为Chlamydiae的细胞壁缺少肽聚糖 所以微生物学家一直不能解释青霉素为什么能够抑制Chlamydiae的生长 肽聚糖合成酶的存在可以帮助说明青霉素的作用 但是Chlamydiae合成肽聚糖的作用是什么 目前还不清楚 70 Chlamydiae缺乏被认为是所有细菌和古细菌在细胞分裂过程中 形成分隔所必须的ftsZ基因 这一点也很让人奇怪 缺乏这种 house keeping 类的基因 那么它是怎么分裂的呢 是否还有一些未知功能的基因在细胞分裂中起主要作用呢 或者Chlamydiae所使用的细胞分裂机制根本就不同于其它原核生物 这些问题都需要进一步的研究来解答 71 随着微生物基因组学的发展 越来越多的问题找到了答案 但越来越多的新问题又提了出来 这表明我们对微生物生物学知识还了解得很少 还有许许多多微生物的遗传学 生理学以及代谢的知识需要我们去学习 甚至以前已经深入研究过的东西都还需要重新审视 微生物基因组学将极大地影响微生物学的许多领域 我们对微生物了解的进展也将有助于对更复杂的真核生物基因组的研究 72 四 几种重要微生物基因组的测序 73 第一个被测序的细胞生物 流感嗜血杆菌 Haemophilusinfluenzae H influenzae是由Pfeiffer于1892年流感世界大流行时 从病人鼻咽部分离出的短小杆菌 当时认为它就是流感的病原菌 不过事实并非如此 基因组大小为1 8Mb 含有1743的基因 在细菌基因组中较为典型 其G C含量为38 与人类基因组十分接近 基因组的测序和初步的注释工作由FleischmannRD TIGR 等于1995等完成并报道 Whole genomerandomsequenc ingandassemblyofHaemophilusinfluenzae Science269 5223 496 512 1995 74 Haemophilusinfluenzae 培养特征 感染症状 75 H influenzae 76 外同心环中推断的编码区用表示它们的功能作用的颜色指出 外周也显示NotI Rsr 和SmaI限制位点 内同心环显示高G C含量 红和蓝 和高A T含量 黑和绿 第三环显示由 克隆所包含的范围 蓝色 第四环显示rRNA操纵子 绿色 tRNA 黑色 和类似mu原噬菌体 蓝色 的位置 第五环显示简单的重复序列和可能的复制起始区 向外指的绿色箭头 红色是潜在的终止序列 77 H influenzae基因组测序的意义 20世纪90年代 关于WGS Wholegenomeshotgun 的可行性有很大争议 许多分子生物学家认为 比较所有的短序列和鉴定重叠区的信息处理量 即使是对于最小的基因组 当时的计算机系统也不可能胜任 作为第一个测序的细胞生物 H influenzae的基因组序列完全是使用WGS而没有借助于任何遗传或物理图谱信息 最终结束了这场辩论 确立了微生物基因组测序方法的事实标准 打开了微生物基因组时代的大门 78 H influenzae基因组序列是人类看到的第一张完整的细胞生物的生命蓝图 它在以后的细菌鉴定 基因注释 比较基因组研究 DNA芯片 蛋白质组研究 宿主和病原菌相互作用的研究 新的疫苗的研制等诸多方面均产生了重大而深远的影响 79 Thepaperhasbeencited2294timesbetween1995and2002 53ofthesecitingpublicationsthemselveshavebeencitedmorethan150timeseach 80 H influenzae基因组测序工作中的一些措施也为随后的基因组测序提供了借鉴 例如 同时构建小片段文库和大片段文库和末端测序相结合 这对测序的精确组装非常重要 严格去除载体序列 对于每一个测序片断需达到一定长度以保证一些小的重复序列在组装时不被遗漏 同时又可以保证其测序的高精确性等等 81 大肠杆菌 E coli 基因组的测序 人们常说 每个分子生物学家都对两种生物感兴趣 一种是所研究的物种 另一种就是E coli 研究人员可以利用实验室中的E coli菌株克隆DNA 表达蛋白质 分离目的基因等 如果没有E coli 实验室将无法工作 82 1997年 非致病的E coli实验室菌株K 12的基因组被公布 这个长为4 6Mb的基因组是由威斯康星大学的FredBlattner实验室测序完成的 这个里程碑式的工作对于了解E coli非常重要 对于怎样进行所有的分子生物学研究也产生了深远的影响 83 GeneticmapofEscherichiacoliK12 84 ProteincodinggenesdistributionmapofEscherichiacoliK12 85 Allpublicationsthatcitedtheoriginalpaperandhavethemselvesbeencitedmorethat100timesareshown 86 关于E coli基因组的测序 E coli基因组的测序由Blattner于1983年首先提出 于1990年正式启动 测序过程可分为几个阶段 期间不断引入新技术 最早测序的1 92Mb位于2 686 777 4 639 221之间 模板来自一系列15 20kb的MG1655菌株DNA的 噬菌体文库 此阶段历时3年 第二阶段的测序工作位于2 475 719 2 690 160之间 开始采用效率较高的自动测序仪 利用popoutplasmid技术直接从细菌染色体中切取出环状的非重叠片断 纯化后用于shotgun法测序 87 基因组最大的一部分位于22 551 2 497 976之间 模板来自11个约250kb的I SceI片断 此法大大减轻了片断间区域重复测序的工作量 最后测序的片断在0 22 551之间 由于此区域不能获得合适的I SceI片段 所以只有选用3个 噬菌体克隆作为模板 但在后续的工作中又发现其中1个 噬菌体克隆存在缺失 不得不使用一个长距PCR的扩增产物来补齐缺口 另外 长距PCR作为首选方法在填补基因组缺口方面起了关键的作用 在测序的扫尾工作中共补齐了38 9kb的缺口 88 测序过程历时7年 最后结果发表在1997年的 science 1997 277 1453 1462 上 ProteincodinggenesmapofEscherichiacoliK12 89 酿酒酵母 Saccharomycesc