促红细胞生成素对大鼠肝部分切除术后肝脏保护和再生的双重作用.doc

促红细胞生成素对大鼠肝部分切除术后肝脏保护和再生的双重作用眼下，肝脏肿瘤切除术是原发或继发肝脏肿瘤患者的比较有效的治疗方式。本研究的目的是评价重组人红细胞生成素的作用(rhEPO)在大鼠肝部分切除术后肝脏的保护和再生中的价值。在行肝脏70%切除术30分钟前，对照组大鼠腹腔内注射生理盐水；实验组腹腔内注射重组人促红细胞生成素rhEPO（(4 U/g）。肝功能评估指标为国际标准化比率(INR)；肝损伤评估指标为血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶 ；肝细胞凋亡由肝内caspase-3活动情况及组织学标准评估；残余肝脏的再生能力由术后7天的再生肝/体重比，免疫组织化学标记细胞增殖因子(ki - 67)、血管性血友病因子 von Willebrand factor)，以及细胞外信号调节激酶的活性评估。对肝切除术后2天和4天的大鼠研究发现，实验组再生肝/体重比显著高于对照组（P 0.005）；实验组血清转氨酶及INR水平显著低于对照组。使用免疫组化及应用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法分析肝内肝caspase-3活性，对照组及实验组没有统计学差异。术后2天，对照组有丝分裂指数,ki - 67和血管性血友病因子的表达和细胞外信号调节激酶的活性明显高于实验组（P 0.005）。综上，通过对实验组及对照组的研究，促红细胞生成素对大鼠肝部分切除术后肝脏保护和再生确实起到了独特的双重作用。眼下，肝脏肿瘤切除术是原发或继发肝脏肿瘤患者的比较有效的治疗方式。但为了避免患者术后几天内出现肝衰竭甚至死亡，确保剩余肝脏功能足够，肝切除范围是有限制的。肝切术后患者均会出现凝血酶原时间延长,国际标准化比率(INR)的水平变化。肝硬化患者肝功能及再生能力较差，所以对肝切除手术的耐受力也较差。所有这些因素都制约了肝硬化患者的肝切除手术。由手术中血流阻断发生的缺血/再灌注损伤(I / R），在肝脏手术后肝功能障碍的发生也有重要影响。切除70%甚至90%的肝脏后，超过90%的干细胞都在自我复制。术后肝脏再生是个复杂的过程，其中大量的生长因子和细胞因子参与调节肝脏再生。诸如核因子kB(NFkB)和胞内信号通路，促分化活化蛋白酶等，此类促进增值、分化的因子在剩余肝脏中大量激活。特别是磷酸化细胞外信号调节激酶、氨基末端激酶、受体酪氨酸激酶促进了这些因子的激活。另外，细胞凋亡在肝脏再生中的作用仍有争论。 促红细胞生成素因其能有效的刺激红细胞生成而命名，但在最新的研究中，也发现其在各种各样的组织损伤,包括心肌和肾脏的缺血再灌注损伤中，起到了强大的保护作用。在EPO结合其受体的过程中，可能也打开了许多细胞内通路，例如促分化活化蛋白酶、JNK, NFkB, 和 PI3K等。研究表明EPO的心脏保护机制包括了：促进血管生成，重建组织结构；抑制NFkB因子及激活蛋白，从而对抗炎症；促进细胞外信号调节激酶的活性；抑制细胞凋亡。以往在独立的大鼠模型上研究发现，EPO通过减弱细胞凋亡，降低JNK、IkBa活性，促进肝内血管生成这些途径保护肝脏，减少了缺血/再灌注损伤。所以，本研究的目的是评价重组人红细胞生成素(rhEPO)在肝切除术后，保护肝脏（缺血/再灌注损伤和细胞凋亡）和肝脏再生方面的作用。材料和方法动物和药物所有实验遵照特拉维夫大学动物保健和使用委员会的指南(特拉维夫,以色列)。手术程序采用成年雄性Wista大鼠,体重250 - 300克, 老鼠被随机分为3组(n=10):(1)空白组,进行了虚假的操作(标记为基准),(2)对照组：肝切除组与生理盐水处理,和(3)实验组：大鼠肝切除前30分钟使用rhEPO处理。因在初步研究中,采用低,高剂量(1和4 U)大鼠腹腔内接种rhEPO测试,高剂量表现出最好的结果，所以实验组老鼠腹腔内预处理方案为hEPO4 U r / g。对照组老鼠腹腔内注射相同体积的溶剂(0.9%生理盐水)。麻醉采用腹腔内注射90毫克/公斤氯胺酮和甲苯噻嗪10毫克/公斤。用70%肝切除术诱导肝脏再生。腹部中线剖腹切口,左、右肝叶和尾状叶使用6-0的丝线缝合和结扎切除肝脏。随机每组第2、4、7去处大鼠肝脏。肝脏/体重重量比(LBWR)切下的肝脏视为占总肝脏70%，并将大鼠称重得到总重（B）。经过术后观察期后，切下一再生的肝脏并称重，得到肝脏重量（A）。肝脏/体重重量比(LBWR)计算功能如下：LBWR （%） =A/B*100肝脏酶学指标收集血清样本，立即置入冰块中，马上送入4oC冷藏。遵照使用说明使用试剂盒测定血清AST、ALT水平。肝内Caspase-3活性测定取下肝脏标本后速冻，并使用Polytron homogenizer均浆器混匀，使用Caspase-3活性测定试剂盒测定其活性病理肝脏切片标本采用标准H&E染色，并由作者随机发放给实验人员观测。每张片子观察10个高倍镜视野。免疫组化观察血管性血友病因子石蜡包埋切片后，使用兔多克隆抗体。免疫组化观察Ki-67免疫组化观察Caspase-3使用dUTP缺口末端标记法(TUNEL)测定末端脱氧核苷酸转移酶Western Blot分析肝脏组织统计学方法结果肝脏/体重重量比(LBWR)切除70%肝脏后，使用rhEPO处理的实验组在第2、4、7天，肝脏/体重重量比明显高于对照组（P 0.005）。LBWR在第4天达到最高峰。实验组大鼠肝脏体积为对照组约1.2倍。生化指标和INR值对照组血清AST、ALT及INR值均高于实验组（P 0.005），特别是在术后第2天。组织学对比空白组，观察对照组及实验组的肝脏H&E染色切片，可以见到对照组镜下出现扩散的微孔液泡和细胞再生(著名的肝细胞细胞核和细胞有丝分裂）的征象，而在镜下观察实验组，出现了最小限度的细胞质液泡化,更多的肝细胞有丝分裂证据。对比监测到的有丝分裂的平均数，实验组明显多于对照组及空白组（P 0.005），特别是在术后第2天。免疫组化观察Caspase-3活性及TUNEL法检测我们使用了3种检测方法，但都不能证实rhEPO在凋亡中的作用。肝组织的匀浆中检测实验组与对照组中激活的caspase-3的区别，也没有统计学意义。免疫组化在实验组及对照组中均发现许多破碎的caspase-3产物，但能染色的激活了的caspase-3确很罕见。免疫组化观察Ki-67对照组与实验组均能观察到Ki-67染色的平均细胞数术后2,4天显著升高，并在第7天快速下降。在术后第2天，实验组均数要高于对照组（P 0.005）.图中可以看到Ki-67染色的细胞实验组明显多于对照组。免疫组化观察血管性血友病因子（vWF）对照组与实验组均能观察到vWF染色的平均细胞数术后2,4天显著升高，并在第7天快速下降。在术后第4天，实验组均数要高于对照组（P 0.005）。途中可以看到，实验组vWF染色仅能看到肝窦内少量细胞质褐染的细胞，而在实验组能见到肝窦内大量细胞质褐染的细胞。Western Blot 分析肝脏组织对照组及实验组均能发现术后ERK信号通路激活，对照组相比空白组提高了2.6倍（P 0.005），这表明术后ERK信号通路将被激活，同事发现实验组比空白组提高了3.6倍（P 0.004）.术后IkBa（NkBa抑制剂）活性显著降低，这表明NkBa通路被激活。讨论使用rhEPO预处理，再行70%肝切除术的实验组确实因rhEPO的治疗受益，同时也提示了一个有效的肝切除术后这一时期，一个独特、双重功效的处理策略。通过检测术后第二天的转氨酶及凝血功能指标，证实rhEPO有保护肝功能作用。通过检测LBWR、有丝分裂指数、Ki-67 和 vWF因子表达，观察ERK信号通路，证实术后第2天rhEPO有促进剩余肝脏再生作用。对比对照组，在肝切除术后早期rhEPO确实呈现出双重保护作用。在一项通过研究有丝分裂、细胞凋亡、细胞分化及Ki-67因子表达的试验中，也证实rhEPO可以提高70%肝切除术后肝脏再生及90%肝切除术后生存率。血管内皮细胞显然有促红细胞生成素受体表达,他们对促红细胞生成素做出增殖的反应。以正玄方式增加的vWF免疫染色提示rhEPO诱发招募新的内皮细胞生产vWF阳性细胞，这提示了肝切除术后rhEPO在组织血管生成的作用。Baruch等证实肝切除术后1小时即可以再肝组织中找到vWF阳性细胞，而新生血管在术后肝组织再生中起到了很大的作用。Sato等展示了肝切除术后血管内皮细胞窦内的有丝分裂，同时提出肝在再生时伴随有新血管的生成。在对肝脏再生的观察中，vWF因子的高表达伴随血管的新生，这也符合新生组织需要新生血管供应的关系。本实验中，实验组大鼠的血管生成作用比对照组明显要高。ERK型号通路的激活对肝组织及血管再生都是一个关键点。肝切除术后ERK通路的激活在体内实验时已发现。EPO可以通过一个独特的ERK通路，提高血管内皮细胞对B淋巴细胞的免疫耐受。本实验也证实了rhEPO可以极大促进ERK的激活。但rhEPO介导的ERK通路如何对肝脏再生和肝细胞增值影响尚不明确，这要归因于体外培养的肝细胞系，如HepG2，虽然它增值，但对EPO介导的ERK通路刺激却没有反应。一种可信的解释是：EPO介导的ERK通路通过各种机制影响了促细胞增值和血管生成激素的释放。通过检测NFkB信号通路的抑制因子IkBs，可以推断NFkB信号通路的活性，NFkB信号通路在肝切除术后立即被激活，但rhEPO并不能直接激活NFkB信号通路。