全氟壬酸对肝脏糖代谢的影响.doc

全氟壬酸暴露对肝脏糖代谢的影响摘要：全氟及多氟化合物（PFCs）广泛应用于工业及民用产品中，高能量的 C-F 共价键使其难以水解、光解、被微生物降解和被动物体代谢，因此在环境中具有持久性并可通过食物链蓄积。2009年 5 月 9 日联合国环境规划署正式将PFCs列为新的持久性有机污染物。研究表明该类化合物暴露水生生物和哺乳动物将导致多系统的毒性效应，包括肝脏毒性、免疫毒性、生殖毒性、发育毒性以及神经毒性等。肝脏是 PFCs 作用的主要靶器官之一，PFCs 能引起实验动物肝脏肿大和坏死，影响肝脏脂质代谢，导致肝细胞脂滴增多，同时也对肝脏抗氧化系统及免疫系统产生影响。最新研究发现人类血清中全氟辛酸（PFOA），全氟壬酸（PFNA）及全氟辛磺酸（PFOS）水平与高血糖症及胰岛素抵抗正相关。肝脏的糖代谢过程受多种因素影响，包括肝细胞脂质积累，氧化应激及炎性因子分泌过多等。近年来，随着人们对链长为八个碳原子的PFOA和PFOS的关注，其使用量有所减少，而具有9个碳原子的PFNA的使用量逐渐增加，其毒性研究亟待开展。另外，PFNA的生物富集因子和毒性比8碳链长的PFOA可能更强，因此本研究拟以PFNA为研究对象，通过实验动物整体实验和离体的原代培养细胞实验，采用现代分子生物学的技术研究PFNA暴露对肝脏糖代谢的影响，并探讨脂质累积，氧化应激以及炎性因子等参与该过程的分子机制。进一步在分子水平上揭示PFNA介导肝脏代谢紊乱的内在机制，从而为正确评估PFCs类持久性污染物的肝脏毒性和对人体健康的影响打下良好基础，为制定PFCs管理策略和替代品研究提供科学依据。一、立论依据（包括项目的研究意义和必要性、国内外研究现状和发展趋势分析，并附主要参考文献及出处。产学研项目还要填写对项目及产品基本情况介绍，包括项目产品的主要应用范围、技术创新点、项目成熟程度、项目完成时所处阶段等内容简介。字数不限）全氟及多氟化合物（PFCs）是一类以氟原子取代所有或大部分碳链上氢原子的有机化合物。PFCs 包括不同碳链长度的系列化合物，主要有全氟羧酸（PFCAs）如全氟辛酸（PFOA），全氟壬酸（PFNA），全氟十碳羧酸（PFDA），全氟十二碳羧酸（PFDoA），全氟磺酸如全氟辛磺酸（PFOS），氟聚物醇等1。PFCs 具有疏水、疏油、耐热、高稳定性和低表面张力等特性，广泛应用于工业及民用产品中。高能量的 C-F 共价键使得 PFCs 难以水解、光解、被微生物降解和被动物体代谢，因此在环境中具有持久性并可通过食物链蓄积。目前，从世界各地采集的环境样品、野生动物血清、组织样品以及人类血清中都检测到不同浓度的 PFCs2-6 。随着研究的不断深入，有关 PFCs 的环境问题已成为国际环境领域关注的热点问题。PFCs 对动物和人类健康的潜在影响引起了人们的广泛关注。研究表明该类化合物暴露水生生物和哺乳动物将导致多系统的毒性效应，包括肝脏毒性、免疫毒性、生殖毒性、发育毒性以及神经毒性等。2006年美国环保署将 PFOA 列为“可能”或“疑似”致癌物质，有可能诱发肝、睾丸、胰脏和乳腺癌。2009年 5 月 9 日联合国环境规划署正式将 PFOS及其盐类和全氟辛基磺酰氟等列为新的持久性有机污染物，同意减少并最终禁止使用该类物质。肝脏是 PFCs 作用的主要靶器官之一，PFCs 能引起实验动物肝脏肿大和坏死。近期有关PFCs的肝脏毒理学效应及其机制研究值得关注的一些重要问题有以下几个方面： （1）肝脏形态学及病理学变化 一定浓度的 PFCs 暴露刺激啮齿动物肝脏相对重量增加，肝细胞明显肿大和坏死，粗面内质网崩解，核染色质固缩和细胞质空泡化，并伴随炎症现象7 。（2）肝脏脂质代谢的影响 PFCs 导致肝细胞脂滴增多，甘油三酯和游离胆固醇水平增加，而血清中甘油三酯降低，表明肝脏脂质动态平衡被干扰。PFCs 能通过激活过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferator，PPARs）引起肝脏脂代谢紊乱、脂质过氧化以及肝细胞癌变等。PPARs有PPARa 、PPAR和 PPARd（或）三种亚型。PFOA及PFOS 均能显著诱导小鼠及大鼠的PPARa表达，PPAR的诱导程度较低8。研究表明，PFDoA 暴露能诱导大鼠 PPARa 及其下游基因 CPT1、 ACOX 和 CYP4A1 显著表达。参与脂类合成的基因如 SERBP-1 c 、SCD-1、HMGR 和脂类转运的基因如ABCA1 均发生不同程度改变。此外，还发现 PFOA 可与 apoB48 相互作用并降低细胞内 VLDL 装配过程中 apoB48 与脂类的结合，从而抑制 VLDL 的分泌9 。以上研究表明 PFCs 暴露对肝脏脂肪分解、合成、分泌及转运均能产生不同程度的影响。（3）肝脏抗氧化系统的影响 PFOA 能显著诱导人肝瘤细胞 HepG2 内活性氧（ROS）的产生10 以及淡水罗非鱼肝原代培养细胞SOD和CAT活性11 。低浓度 PFDoA 可以诱导雄性大鼠肝脏产生大量的 ROS ，这可能是通过增强脂肪酸-氧化实现。然而，高浓度 PFDoA 处理组发生严重的脂质过氧化，SOD和CAT活性受到显著抑制，同时 TBARS 含量显著降低12 。（4）肝脏细胞致癌性 慢性PFOA 暴露可显著增加雄性大鼠肝脏瘤的发生率，推测这与 PFOA 作为过氧化物酶体增殖剂（PP）有关13 。PP 诱导啮齿类动物肝细胞瘤的可能机制：一是增强肝脏过氧化物酶体-氧化，在脂肪酸氧化过程中产生大量过氧化氢，导致肝脏受到氧化胁迫；二是细胞分化增加，两者结合，导致肿瘤产生。如 PFOS 和 PFOA 可引起动物肝细胞内活性氧的产生及一系列抗氧化反应，导致氧化损伤，如脂质过氧化和 DNA 损伤，从而诱导肿瘤发生。（5）肝脏炎症现象 PFDoA 暴露大鼠诱导肝脏炎症现象发生9 。毒理基因组学分析表明PFOA暴露导致小鼠肝脏中与炎性反应有关的基因如 C3, C4, Ccl9, Cfh, Cxcl12, Cxcr3, H2-Bf 等均发生不同程度的变化。最新研究发现血清PFOS、 PFOA及 PFNA 水平与高血糖症正相关， PFOS 水平与胰岛素抵抗正相关14 。基因组学分析发现 PFOA 暴露导致幼鼠肝组织中与糖代谢相关的基因表达发生变化15 表明PFCs 暴露影响肝脏的糖代谢过程。然而其具体的机制目前尚不清楚。推测可能的原因有：1. PFCs 导致肝细胞脂质积累，而增加的二酰基甘油（DAG）能激活蛋白激酶 PKC， PKC可与胰岛素受体结合抑制其酪氨酸激酶活性，从而产生胰岛素抵抗16 ； 2. PFCs 导致肝脏产生氧化应激，破坏线粒体膜完整性，致肝细胞中解偶联蛋白（UCP2）表达增多17 ，而 UCP2 是 B 细胞胰岛素分泌的一个重要的负向调节因子。3. PFCs 可导致肝脏炎症发生，炎性因子 TNFa、IL-1 及 IL-6 均能引起胰岛素抵抗18。TNFa 通过激活JNK和IKKb影响胰岛素受体亚基（IRS）的丝氨酸磷酸化，抑制胰岛素信号通路 19；另一方面，TNFa和IL-1 能促进 IL-6 分泌增加，IL-6能抑制肝糖原生成，并抑制IRS-2连接的PI3激酶的激活从而产生胰岛素抵抗20。 此外，IL-6能增加SOCS-3表达，并通过该蛋白抑制胰岛素受体的活性21。本项目拟以PFNA为研究对象，通过实验动物整体实验和离体的原代培养细胞实验，采用现代分子生物学的技术研究PFNA暴露对肝脏糖代谢的影响，并探讨脂质累积，氧化应激以及炎性因子等参与该过程的分子机制。进一步在分子水平上揭示PFNA介导肝脏代谢紊乱的内在机制，从而为正确评估PFCs类持久性污染物的肝脏毒性和对人体健康的影响打下良好基础，为制定PFCs管理策略和替代品研究提供科学依据。主要参考文献1. Prevedouros K, Cousins IT, Buck RC, et al. Sources, fate and transport of perfluorocarboxylates. Environ. Sci. Technol., 2006, 40, 32-44.2. Giesy JP, Kannan K. Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife. Environ. Sci. Technol., 2001, 35(7): 1339-1342.3. Kim SK, Kannan K. Perfluorinated acids in air, rain, snow, surface runoff, and lakes: relative importance of pathways to contamination of urban lakes. Environ. Sci. Technol., 2007, 41(24):8328-8334.4. Peng H, Wei Q, Wan Y, et al. Tissue distribution and maternal transfer of poly- and perfluorinated compounds in Chinese Sturgeon (Acipenser sinensis): implications for reproductive risk. Environ. Sci. Technol., 2010, 44(5): 1868-1874.5. Ju X, Jin Y, Sasaki K, et al. Perfluorinated surfactants in surface, subsurface water and microlayer from Dalian Coastal waters in China. Environ. Sci. Technol., 2008, 42(10):3538-3542.6. Pan Y, Shi Y, Wang Y, et al. Investigation of perfluorinated compounds (PFCs) in mollusks from coastal waters in the Bohai Sea of China. J. Environ. Monit., 2010, 12(2):508-513.7. Hekster FM, Laane RW, de Voogt P. Environmental and toxicity effects of perfluoroalkylated substances. Rev. Environ. Contam. Toxicol., 2003, 179:99-121.8. Vanden Heuvel JP, Thompson JT, Frame SR, et al. Differential activation of nuclear receptors by perfluorinated fatty acid analogs and natural fatty acids: a comparison of human, mouse, and rat peroxisome proliferator-activated receptor-alpha, -beta, and -gamma, liver X receptor-beta, and retinoid X receptor-alpha. Toxicol. Sci., 2006, 92(2): 476-489.9. Okochi E, Nishimaki-Mogami T, Suzuki K, et al. Perfluorooctanoic acid, a peroxisome-proliferating hypolipidemic agent, dissociates apolipoprotein B48 from lipoprotein particles and decreases secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes. Biochim. Biophys. Acta., 1999, 1437(3): 393-401.10. Panaretakis T, Shabalina IG, Grandr D, et al. Reactive oxygen species and mitochondria mediate the induction of apoptosis in human hepatoma HepG2 cells by the rodent peroxisome proliferator and hepatocarcinogen, perfluorooctanoic acid. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2001, 173(1):56-64.11. Liu C, Yu K, Shi X, et al. Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia (Oreochromis niloticus). Aquat. Toxicol., 2007, 82(2):135-143.12. Liu Y, Wang JS, Wei YH, et al. Induction of time-dependent oxidative stress and related transcriptional effects of perfluorododecanoic acid in zebrafish liver. Aquat. Toxicol., 2008, 89(4):242-250.13. Biegel LB, Hurtt ME, Frame SR, et al. Mechanisms of extrahepatic tumor induction by peroxisome proliferators in male CD rats. Toxicol. Sci., 2001, 60(1):44-55.14. Lin CY, Chen PC, Lin YC, et al. Association among serum perfluoroalkyl chemicals, glucose homeostasis, and metabolic syndrome in adolescents and adults. Diabetes Care. 2009, 32(4):702-707.15. Rosen MB, Thibodeaux JR, Wood CR, et al. Gene expression profiling in the lung and liver of PFOA- exposed mouse fetuses. Toxicology. 2007, 239(1-2):15-33.16. Postic C, Girard J. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic steatosis and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. J Clin Invest., 2008, 118(3):829-838.17. Panaretakis T, Shabalina IG, Grandr D, et al. Reactive oxygen species and mitochondria mediate the induction of apoptosis in human hepatoma HepG2 cells by the rodent peroxisome proliferator and hepatocarcinogen, perfluorooctanoic acid. Toxicol Appl Pharmacol., 2001, 173(1):56-64.18. Leclercq IA, Da Silva Morais A, Schroyen B, et al. Insulin resistance in hepatocytes and sinusoidal liver cells: mechanisms and consequences. J Hepatol., 2007, 47(1):142-156. 19. Hotamisligil GS. Inammation and metabolic disorders. Nature, 2006; 444:860-867.20. Kim HJ, Higashimori T, Park SY, et al. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 2004, 53(4):1060-1067.21. Senn JJ, Klover PJ, Nowak IA, Zimmers TA, Koniaris LG, Furlanetto RW, et al. Suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS-3), a potential mediator of interleukin-6-dependent insulin resistance in hepatocytes. J Biol Chem., 2003, 278:13740-13746. 二、研究方案1、总体思路、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（分段论证，字数不限，可加页）（产学研项目还要填写：（1）项目依据的技术原理，包括文献、专利，或发明等；（2）国内外相关技术的研究、开发现状的介绍、分析；（3）采用的现有成熟关键技术、已攻克的关键技术、待研究的关键技术等；（4）预计项目完成时计划解决关键技术及达到的技术性能指标、实现的质量标准类型、标准名称。指标要尽可能量化，该指标为验收考核指标）1. 总体思路以大鼠为实验动物，在整体水平上研究不同剂量PFNA暴露后，大鼠血清中血糖及胰岛素水平的变化，并进一步从组织水平、基因及蛋白质水平研究PFNA对大鼠肝脏糖代谢通路的关键因子的调节作用。同时检测PFNA暴露对肝细胞脂类代谢的影响，检测氧化应激及炎症现象，并进一步探讨脂质累积，氧化应激以及炎性因子对肝脏糖代谢的参与机制。在离体细胞水平上，探讨PFNA单独暴露，以及分别与重组炎性因子以及自由脂肪酸共同暴露后对原代培养的肝实质细胞中糖代谢相关基因蛋白的影响，考察炎性因子及脂质累积对糖代谢的调节作用，确定PFNA调节糖代谢的关键因素及具体途径。 2. 研究目标（1）阐明PFNA暴露实验动物后，对其肝脏糖代谢的具体影响；建立PFNA暴露与肝脏糖代谢紊乱的剂量效应关系。（2）从整体和离体水平研究PFNA对肝脏脂质代谢、氧化应激及炎症的影响，并进一步探讨脂质累积、氧化应激及炎性因子对肝脏糖代谢的调节机制。（3）确定PFNA调节糖代谢的关键因素及具体途径，寻找敏感因子，从而为正确评估PFCs类持久性污染物的肝脏毒性和对人体健康的影响打下良好基础，为制定PFCs管理策略和替代品研究提供科学依据。3. 研究内容（1）观察不同浓度PFNA暴露对大鼠的体重、肝脏重量的影响，探讨剂量效应关系；采用光镜观察肝脏组织的常规形态学变化；测定不同浓度PFNA暴露下，血清中血糖浓度、胰岛素水平及炎性因子TNFa、IL-1和IL-6等的变化。（2）在基因及蛋白水平上研究PFNA对肝脏糖代谢的作用机制。包括肝脏胰岛素信号通路的主要基因蛋白如ChREBP、GK、GLUT-2、PEPCK、G6Pase、Foxo 1、PGC-1、IRS、PI3K及AKT的基因表达及蛋白磷酸化的变化；脂代谢相关基因PPAR、 CPT1、SREBP-1、CYP4a1及PKC的表达变化；氧化应激相关指标ROS 、 SOD、GSH、GSH-Px以及UCP2的表达变化；炎性因子的下游基因JNK、 IKK和SOCS-3的表达变化，通过这些研究在整体水平上来揭示PFNA对肝脏糖代谢的作用机制，寻找潜在的分子靶标。（3）在离体细胞水平上进一步揭示PFNA影响肝脏糖代谢的分子机制。原代培养的大鼠肝细胞暴露PFNA、PFNA重组细胞因子IL-6及PFNA自由脂肪酸（FFA）后比较糖代谢相关基因蛋白ChREBP、GK、GLUT-2、PEPCK、G6Pase、Foxo 1、PGC-1、IRS、PI3K及AKT的基因表达以及炎性因子的下游基因JNK、IKK和SOCS-3的表达变化，考察炎性因子及脂质累积是否参与PFNA导致的肝脏糖代谢紊乱。4. 拟重点解决的科学问题（1）通过测定PFNA暴露后血清中血糖水平、胰岛素水平、肝脏中与糖代谢相关基因及蛋白的表达变化，阐明PFCs类化合物暴露对动物肝脏糖代谢的具体影响。（2）考察PFNA暴露对肝脏脂质代谢、氧化应激以及炎性因子的影响，从整体和细胞水平研究肝脏脂质累积、氧化应激及炎性因子参与肝脏糖代谢的分子机制。（3）确定PFNA调节糖代谢的关键因素及具体途径，寻找敏感因子，有利于更深入，更细致地揭示PFNA肝脏毒性机理。2、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（字数不限，可加页）：（产学研项目主要描述申报项目研究开发的内容及涉及的关键技术、关键问题的解决方案；技术路线描述包括工艺流程图、产品结构图、框架图等）1. 研究方案如下：（1）大鼠分别以不同剂量的PFNA暴露（灌胃）后，观察体重、肝脏重量的变化；HE染色观察组织病理学变化，油红染色（Oil red）观察脂质累积变化。（2）通过放射免疫法（RIA）和酶联免疫法（ELISA）测定血清中血糖浓度、胰岛素水平及TNFa、IL-1和IL-6浓度。试剂盒（kits）检测肝脏氧化应激指标ROS 、 SOD、GSH及GSH-Px等。（3）通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）及Western Blot（WB）研究上述PFNA暴露引起糖代谢通路中相关基因蛋白的表达变化如ChREBP、GK、GLUT-2、PEPCK、G6Pase、Foxo 1、PGC-1、IRS、PI3K及AKT等；与脂代谢相关基因的表达变化如PPARa、CYP2b、 CYP1a1、CYP4a等；连接脂代谢与糖代谢的蛋白PKC的表达变化；与氧化应激相关基因的表达变化如UCP2；炎性因子的下游基因JNK、IKKb和SOCS-3的表达变化等。（4）离体实验部分：在体原位肝脏灌注及Percoll分离液分离肝实质细胞，贴壁培养；台盼兰染色测定细胞活度，采用MTT法检测细胞活性。以不同剂量的PFNA、PFNAIL-6及PFNAFFA暴露细胞，用RT-PCR和Western Blot检测不同暴露方式对肝实质细胞糖代谢、脂代谢及氧化应激相关基因蛋白的表达影响。2. 主要技术路线如下： 整体实验 离体实验 3. 可行性分析（1）本项目立项