显微切片论文.doc

激光显微切割技术及其在植物细胞研究中的应用激光显微切割(Laser mierodisseetion，LM或LMD)是显微观察和分子生物学研究之间的桥梁。它将在显微镜下观察到的目标细胞直接用激光取出，从而与旁邻的其他细胞分开，并且可以将目标细胞放入试管中进行分子生物学的分析研究。从激光类型和技术原理上分，目前主要存在基于近红外激光(810nm波长)的激光捕获显微切割和基于紫外激光(337355nm波长)的激光显微切割两种。一 激光显微切割技术1 发展历史利用激光分离细胞的研究开始得较早1，但是直到1996年基于近红外激光熔膜原理的激光捕获显微切割(laser capture mierodissection，LCM)成功应用于动物细胞的切割和DNA、RNA分析2后，这一技术才在生物研究中迅速发展并被广泛应用。而在植物研究中的成功应用，则又滞后了6年3-4。20032005年间，激光显微切割技术在植物研究中的应用逐渐发展，越来越受重视5-7。2 LM的基础原理激光捕获显微切割技术(LCM)是在组织切片上方悬着机械臂控制的收集管,收集管的塑料帽表面有一层乙烯乙酸乙烯酯(Ethylene Vinyl Acetate,EVA)的热塑膜,在显微镜下选择好目标细胞后,发射低能红外激光脉冲,瞬间升温使EVA膜融化与目标细胞黏合再迅速凝固。接着目标细胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并随着塑料帽一起移走。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上,分离的细胞就转移至离心管中,从而可以分析出目标细胞的分子生物学特征,用于进行后续研究2, 8。激光显微切割技术(LMD)需要将标本切片装片在薄膜载玻片或者薄膜覆盖的玻璃载玻片上9。脉冲紫外激光(UV-A)通过物镜聚焦在切片上,沿着目标区域的边缘移动切割,使选择区域内的细胞脱离下来且周围组织完好10。德国PALM公司出售的LMD系统采用的是倒置显微镜,切割后目标细胞群由激光微切割弹射系统(Laser Microdissection and Pressure Catapulting, LMPC)弹进放在样品之上的微型管中11。而德国Leica公司的Leica AS LMD采用的是正置显微镜,切割的组织细胞借助自身重力掉落至载物台下的微量离心管中,避免了污染12。3 LM的优点3.1 方法快速、简便、易行激发激光、转运膜捕获目的细胞,一步完成,易掌握,易操作,有利于科研和临床诊断领域推广应用。与常规的显微切割技术相比避免了繁琐的操作以及无关细胞和碎片的污染。每片转运膜可经受1 0003 000次激光脉冲,捕获6 000个以上的细胞。每次激发耗时不超过1秒13,可在极短的时间内获得大量单一类型的细胞。3.2 准确度高激光定位的准确程度可以达到1m,捕获点范围达到35m,因而足以捕获单个细胞,同时还可以根据细胞的形状、大小调整激光束的功率和直径。3.3 细胞形态保持完好与手工显微切割对组织细胞研磨破坏不同,LM在显微镜直视下,使用多聚体膜捕获目的细胞,无损伤破坏,保持了其完整的组织形态,并在计算机上记录下被捕获前后的影像,既有利于保证捕获的准确性,也使实验结果更可信、更具说服力。另外,LM并未破坏切片中剩余组织,完全可以在分子水平对相邻细胞(群)进行对比分析研究,这是以往的显微切割方法所无法比拟的。3.4 细胞内分子结构保持完整转运膜轻微、短暂的温度变化对细胞内DNA、mRNA以及蛋白质均无损伤,热塑性粘合避免了分子间的交联反应,其良好的水溶性也保证了下一步提取DNA、mRNA以及蛋白质的顺利进行。3.5 特异性强LM可以从免疫组化染色14的组织切片中分离、纯化具有不同抗原表型的细胞群加以研究,大大地增加了取材的特异性、目的性。二 激光显微切割技术在植物细胞研究中的应用进展高等植物是一个复杂的有机体,每部分器官都是由一种或多种组织构成,不的组织包含各种各样的细胞,细胞进一步分化行使不同的功能,植物细胞共有40多种。取材于混合的异质组织进行细胞分析,其结果往往是数量较大的那几类细胞的综合平均值。为了研究某种细胞或组织的特殊功能,就必须对特殊的细胞类型进行单一分离和分析。近几年来,随着激光显微切割技术的进步,尤其是低能激光技术的发展,在植物研究中的应用更加广泛。它能够快速准确地将目标细胞或细胞群从活体植物组织中分离出来,用于后续的研究或进一步的活体培养。另外,激光显微切割技术与各种分子生物学研究方法的结合,使得对植物的生长发育过程中细胞功能和分化研究更加准确易行。用于激光显微切割的植物组织制片技术的改进：激光显微切割技术最初是从医学中发展起来的。而植物细胞与动物细胞相比有很大的差异,植物细胞具有的细胞壁和液泡,尤其是多年生木本植物,存在细胞壁的次生加厚生长,更增加了组织样品制备的难度。而组织制备必须兼顾组织学和生物化学上的特性,既要使组织在视觉形态上尽可能完好,且同时能最大限度地回收核酸和蛋白质。近期有研究表明,对激光显微切割技术的参数作少许改变,就可以成功地应用于植物研究,从而在组织甚至细胞水平上革新对植物的组织、细胞的分子生物学研究15。虽然最初的组织制备过程和切割条件的优化会是一个艰巨而复杂的过程,但对于植物学研究来说,这几乎是保证后续的DNA、RNA和蛋白质分析最为关键的步骤。1.切片方法的选择与优化一般显微切割技术的样品采用快速的冰冻制片法。该方法整个过程简便、耗时短,只需将组织用固定液固定之后再用包埋剂(例如OCT或者水等)包埋,最后在冰冻切片机上完成切片。冷冻组织提供了高质量可回收的大分子,故激光显微切割技术是切割动物组织时优先选用冰冻制片法。但是冰冻切片法也存在一些缺点,如频繁的冷冻会使组织内产生大的冰晶从而破坏了组织学特征,增加了形态辨认的难度。植物样品比动物样品的含水量要大得多,成熟的植物细胞中央大液泡可占据细胞体积的90%以上,其中的水分在样品的冷冻过程中极易形成冰晶,从而破坏细胞结构。因此常规冰冻切片法容易造成植物切片卷曲或断裂及细胞破碎等问题。若对常规冰冻制片方法加以改进,使组织在制片过程中保持完好,则冰冻制片法就可以适合植物切片。如快速冷冻法能使水分在毫秒或者更短的时间内结晶,由于结晶的过程非常迅速,致使细胞内外的介质变得更为黏稠,无法形成较大的冰晶,因而植物样品能保持良好的形态结构。另外,还可以采用添加冷冻保护剂的方法。冷冻保护剂的作用机理是保护剂与组织细胞中的水分结合,降低细胞内溶液的冰点,使形成冰晶或较大冰晶的机会减小,从而减轻细胞内冰晶对细胞及其组分的损伤。根据以上特性,陈丹等人以蔗糖作为冷冻保护剂,采用液氮作为速冻剂,建立了蔗糖保护液氮速冻法,较好地保存了植物样品的细胞结构,从而获得薄而结构完整的切片16。这种方法适用于植物多种花器官,并且通过某些细节上的改进,可以推广到植物体的各种组织和器官。目前已经有一些采用冰冻切片法制片,进一步用激光显微切割技术从细胞水平和分子水平研究植物的报道17-20。另一种制片方法是石蜡制切片法。虽然石蜡切片能保存完好的组织形态学特征,但是固定液可能会改变大分子的结构从而影响它们的完整性和可提取性。实验表明,加入沉淀类固定剂可以改善石蜡切片的性能。沉淀类固定剂(例如乙醇或丙酮)比醛类固定剂(例如甲醛等醛类物质)要好,因为前者对核酸和蛋白质有更好的复性作用21。石蜡包埋与冷冻组织切片相比,会对总体可提取的RNA和蛋白质有一定的降解作用。但仍可从动植物组织中获得相当数量的RNA在RT-PCR扩增之后作RNA表达分析22。如Kerk等将LCM应用到玉米、西红柿的各种组织的石蜡切片中,从分离的不同细胞中分别提取RNA,扩增之后可适用于基因表达研究23。目前用于激光显微切割的植物组织制片方法在不断改进和创新以适应激光显微切割技术的应用。Noriko Inada用快速微波石蜡法制备拟南芥叶片的切片24。此方法制作的切片完好地保存了拟南芥叶片的形态,激光显微切割之后从叶片表皮和叶肉细胞中提取的RNA在RT-PCR之后足以应用于下游的微阵列等分析。2.加强目标细胞识别的准确性由于激光显微切割技术的组织切片与标准光学和电子显微镜技术的组织学标本有差别,对操作者鉴别与标准形态学有差异的目标细胞的能力提出了更高要求。又由于在激光显微切割技术中,载玻片上没有盖玻片,使得组织辨认更加困难,有时候为了识别一些特殊的细胞,会对目的细胞群体进行染色,但是有些染色过程不仅加快了活质物质的降解过程,而且可能会引起细胞成分发生未知的改变25。用快速免疫染色技术则可以减少RNA的降解,另外,转基因植物中在特殊细胞类型里报告基因的表达也可以用来识别目标细胞。随着更完善的技术系统和商业试剂盒的问世,激光显微切割技术向着更加完善的方向发展,为植物细胞研究提供了一个便捷可靠的平台。总之，近年来激光显微切割技术越来越多在植物研究中应用,实验质量也在逐步提高, 使这一技术正成为植物研究者的常用工具。参考文献1. 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