加强抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法的规范化及合理应用.doc

加强抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法的规范化及合理应用 赵明辉章友康王海燕抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是近10年来发展起来的，用于诊断原发性小血管炎的极为重要的血清学诊断工具。与ANCA相关的小血管炎主要指韦格纳肉芽肿(WG)、显微镜下型多血管炎(MPA)及原发性局灶节段坏死性肾小球肾炎(FSNGN)1。最早的ANCA检测方法为间接免疫荧光法(IIF)，应用酒精固定的中性粒细胞可产生两种荧光形态：即胞浆型(cANCA)和环核型(pANCA)。以后又有酶联免疫吸附法(ELISA)，根据应用的抗原的不同又分为总抗原ELISA和抗原特异性ELISA，蛋白酶3(PR3)和髓过氧化物酶(MPO)是两个最为重要的ANCA特异性抗原。近10年来国外在ANCA的方法学上做了许多探讨和尝试，已经基本上形成了较为规范化的检测方法和检测程序24。国内自90年代初开始检测ANCA5，但方法学上较为混乱，并无统一标准，影响了ANCA的推广及应用，甚至导致临床的误诊。我们将结合自己的点滴体会重点介绍国际上形成共识的ANCA检测方法及应注意的问题。一、IIF法目前仍为最常用的方法。应注意如下几个问题。1.根据1988年哥本哈根第一届ANCA国际研讨会所制定的方法，应选用正常健康人肝素抗凝血分离全体白细胞。其中除ANCA的靶细胞中性粒细胞和单核细胞(monocyte)外，还应包括淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，后两者是非常重要的内参照物。淋巴细胞可用来判断自身抗体是否为中性粒细胞和单核细胞所特异的，从而帮助鉴别pANCA和抗核抗体(ANA)：pANCA仅识别中性粒细胞和单核细胞，而ANA则同时还识别淋巴细胞的胞核。嗜酸性粒细胞有两种用途：其一，帮助判断ANCA的荧光强度，根据ANCA荧光亮度与嗜酸性粒细胞的天然荧光相比较，可确定ANCA荧光亮度的分级。其二，嗜酸性粒细胞天然荧光还可以帮助判断制片是否成功，细胞形态是否满意。嗜酸性粒细胞胞浆内有粗大均匀一致的颗粒，在紫外光激发下可产生暗黄绿色的均匀一致自然荧光，形似cANCA。典型的cANCA为胞浆不均匀着色，在细胞核核叶之间有重染，有时形成小团块或粗大颗粒状。故应注意区分，切忌将二者混淆。2.分离的白细胞应均匀一致呈单层涂布于玻片上，不可有成堆或重叠的白细胞，标准的方法应选用细胞离心机(cytospin)将白细胞甩至玻片呈单层均匀分布，并可使细胞浆及细胞核平展充分。3.目前最为常用的固定剂是预冷的纯酒精，纯酒精和丙酮一样，属于非交联性固定剂，增加细胞膜结构的通透性，这样带正电荷的蛋白质如MPO则可穿透膜结构游离出来，并结合到带负电荷的细胞核成分上，致使抗MPO自身抗体形成环核型的pANCA。如应用交联性固定剂如福尔马林或多聚甲醛可使部分ANCA的特异性抗原失去与自身抗体相结合的能力6，其次，MPO等蛋白质则被固定在原位上(嗜天青颗粒内)，无法产生不同形态的ANCA，而不利于判断。基于上述两种原因，国际上并不主张应用交联性固定剂。4.每次检测均应有阴性对照、cANCA和pANCA的阳性对照。有条件者应在每张玻片上加一阴性对照(每张玻片上至少有两孔白细胞膜方可)。5.判断IIF结果时，应由两位受过培训的医师或技师在双盲条件下读片以除外主观因素。读片时应在低倍镜下判断是否阳性，在高倍镜下观察形态并判断cANCA或pANCA。在IIF检查中，pANCA和ANA很难区分，应用淋巴细胞和交联性固定剂有时可有帮助。但如果两者并存，特别是ANA滴度较高时则鉴别极其困难，二者可互相掩盖。因此，ANA阳性，特别是强阳性者，应用IIF法检测ANCA是不可取的，其结果也是不可靠的。二、ELISA法总抗原ELISA法是应用中性粒细胞胞浆的酸性粗提物作为抗原，理论上应包括所有ANCA抗原，但实际上并非如此，其原因如下。1.中性粒细胞胞浆内各种成分含量不一，含量高者易于竞争包被到ELISA板上。2.不同的蛋白质在同一种包被液中(如0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)结合到ELISA板上的能力也不同。3.中性粒细胞胞浆内富含各种蛋白水解酶，可以互相降解或消化。目前认为，利用总抗原检测抗PR3和抗MPO自身抗体还是非常成功的，但对其他抗原来说其敏感性则不够。总抗原ELISA的缺点是不能确定抗原特异性，敏感性也较IIF法稍差。总抗原ELISA对于多数基层医院在无荧光显微镜的情况下，仍是简便、较为可信的方法。但对高度怀疑小血管炎，而总抗原ELISA阴性者拟送有条件的单位再做进一步的检测。抗原特异性ELISA是较为理想的方法，特别是PR3-ELISA和MPO-ELISA，在西方发达国家已普遍使用。抗原特异性ELISA多用高纯度的抗原直接包被ELISA板。但检测抗PR3自身抗体也可以应用夹心法ELISA，该方法以抗PR3单克隆抗体包被到ELISA板上并用其捕捉PR3分子作为抗原，有人认为夹心法ELISA较直接包被的抗原特异性ELISA更敏感，因为PR3的抗原决定簇是立体构型，PR3直接结合到ELISA板上会丧失部分抗原决定簇7。三、ANCA的应用及方法的选择90年代以来，诸多ANCA特异性抗原被发现，除PR3和MPO外，还有杀菌/膜通透性增高蛋白(BPI)、弹力蛋白、组蛋白酶G、乳铁蛋白、防御素和天青杀素等。不同的抗原抗体系统往往与不同的临床疾病相关。例如，抗PR3自身抗体与WG密切相关，抗MPO自身抗体则多见于MPA和FSNGN，而抗BPI自身抗体可见于肺部炎症性疾病等8。因此，仅有IIF阳性来诊断原发性小血管炎是不够的，还应检测抗原特异性ELISA以协助不同临床疾病的诊断和了解疾病的发病机制。此外，ANCA监测对于指导治疗、预测复发均有重要作用。对于怀疑原发性小血管炎的患者，应首先应用IIF法和(或)总抗原ELISA法进行筛选，阳性者则应进一步用ELISA法检测抗PR3和抗MPO等自身抗体，如IIF法检测ANCA为阳性，而PR3-ELISA和MPO-ELISA均为阴性，则应用ELISA方法检测其他已知的ANCA特异性抗原。研究结果显示单独使用IIF法对原发性小血管炎的诊断特异性为76%，如IIF法加抗原特异性ELISA则可使诊断的特异性提高至98%。作者单位：100034北京医科大学第一医院肾内科参考文献1GrossWL,CsernokE,HelmchemU.Antineutrophilcytoplasmicautoantibodies,autoantigens,andsystemicvasculitis.APMIS,1995,103：81-97.2WiikA.DelineationofastandardprocedureforindirectimmunofluorescencedetectionofANCA.APMISSuppl,1989,6：12-13.3HagenEC,AndrassyK,CsernokE,etal.ThevalueofindirectimmunofluorescenceandsolidphasetechniquesforANCAdetection.AreportonthefirstphaseofaninternationalcooperativestudyonthestandardizationofANCAassays.EEC/BCRGroupforANCAAssayStandardization.JImmunolMethods,1993,159：1-16.4HagenEC,AndrassyK,CsernokE,etal.Developmentandstandardizationofsolidphaseassaysforthedetectionofanti-neutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA).AreportonthesecondphaseofaninternationalcooperativestudyonthestandardizationofANCAassays.JImmunolMethods,1996,196：1-15.5赵明辉，王海燕，章友康.五例原发性小血管炎引起肾损害的临床病理分析.中华内科杂志，1993，32：40-43.6LacourBB,WiikA,Hoier-MadsenM,etal.Clinicalcorrelatesandsubstratespecificitiesofantibodiesexhibitingneutrophilnuclearreactivity.Amethodologicalstudy.JImmunolMethods,1995,187：287-295.7BaslundB,SegelmarkM,WiikA,etal.Screeningforanti-neutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA):isindirectimmunofluorescencethemetho