食用菌液体发酵罐制种技术.docx

食用菌液体发酵罐制种技术食用菌制种主要有液体和固体两种制种方式。液体制种是目前国际上通用的、先进的方法。液体菌种具有生产周期短、用工成本低、菌丝活力强、接种后萌发吃料快、菌种在培养基中的流动性和分散性好、菌龄一致、出菇整齐、可缩短栽培时间等优点。在对液体制种与固体制种经济效益分析比较中指出，液体菌种发育时间可以减少24d，接栽培袋菌丝满菌时间缩短约10d，污染率可以降低1.5%，成本利润率可提高42%。液体菌种作为食用菌基料工厂化生产发展过程中的重要环节，具有重要意义。而现在食用菌产业受资金和技术的限制，其规模化、工厂化生产仍然以固体菌种为主，液体菌种的应用只有少数较大规模工厂化生产的企业及少数栽培品种工厂化栽培中获得应用，液体菌种的优势完全没有发挥出来。液体菌种在制作过程中对设备、技术的要求较高，液体菌种发酵罐的操作技术流程复杂，增加了使用者的生产难度。我们将对食用菌液体菌种发酵罐的生产工艺、操作流程进行技术总结，为食用菌项目的液体菌种提供参考。1、研发液体菌种发酵罐的构造液体菌种在发酵培养过程中需要充足的氧气，属好氧性发酵。满足于好氧性发酵的生化反应器主要有两大类即机械搅拌通风发酵罐和气流搅拌发酵罐。前者利用通风装置和搅拌装置将氧溶入发酵液中，因机械搅拌剪切力而对菌丝产生破坏作用，因此不适于栽培型菌种的应用。而后者则利用外部供气装置将气体通入发酵罐内形成环流将氧溶入发酵液中，其特点是基质溶液分布均匀、具有较高的溶解氧速率和溶解氧效率、结构简单、易于加工和操作。而气流搅拌发酵罐的构造主要由电控系统、气体输送系统、发酵培养系统三部分组成。1.1电控系统。由控制箱体、微型电脑、集成传感器、报警器、数码显示屏、控制开关等组成，可调控灭菌温度、时间、压力及培养温度等。1.2气体输送系统。由无油隔膜泵、气水分离器、空气过滤器、滤芯、止回阀、压力表、硅胶管等组成，可为发酵罐提供纯净、无菌的气源。1.3发酵培养系统。由发酵罐体、鼓泡器、加热管、进气阀、接种阀、冷却水进出孔、压力表、安全阀、排气阀、接种孔、视镜等组成，液体菌种的灭菌、接种、发酵培养都在发酵罐体内完成。2、食用菌栽培一级种子的制备适宜的生长条件对发酵结果很重要，发酵必须用生长良好的种子进行接种。一级种子的培养通常是在摇瓶中进行，所使用的2L三角瓶中种子培养基的装量为500mL。二级种子可在发酵罐中培养。其生产工艺流程如下：试管母种试管母种扩繁一级种子摇瓶培养二级种子发酵罐培养液体菌种转接栽培袋。2.1母种准备。食用菌母种通常在PDA或改良的PDA斜面培养基上生长良好。长期冰箱保存的母种必须在新鲜的培养基上转接，活化后才能作为液体培养的种子。也可用当年栽培的子实体进行组织分离，可获得纯度高、菌丝健壮、生命力强、色泽纯正的母种。2.2摇瓶菌种准备。母种培养好后再转接入5001000mL的三角瓶中扩大培养。摇瓶菌种可用配方马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母膏2g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B11粒，水1000mL，pH自然。每瓶可装200300mL培养基在0.130.15MPa压力、121条件下，灭菌40min。在无菌条件下接种到三角瓶内，置于摇床上振荡培养，摇床振荡频率为80100r/min，温度控制在2426，培养46d即可。3、食用菌二级种子发酵培养罐的清洗与检查培养基制作上料培养基灭菌降温发酵罐接种培养栽培袋接种。3.1发酵罐的清洗和检查。一是新购的发酵罐或是使用过的发酵罐，在生产前都必须对罐内进行彻底清洗。清除罐壁上菌球、菌块、菌皮、料液及其它污垢，用清水冲刷干净。二是检查各个阀门、加热管、电控系统、气泵、压力表等是否正常，如有故障及时排除。3.2煮罐空消。新罐初次使用、上一罐污染、更换生产品种或罐长时间放置重新使用时，须对罐体内部进行彻底消毒。方法是加水至视镜中线，扣紧接种盖，关闭排气阀，打开启动开关，当温度达到100时，排气阀微开。温度达到121时计时40min，关闭排气阀，闷20min后放水。放水结束后，再用水从进料口反复刷罐数次，使罐内残存物排放干净。3.3培养基制作与上料。可用配方葡萄糖30%，玉米粉1%，黄豆粉2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%，pH自然，适用于多种食用菌菌种的液体培养。依据液体发酵罐的容积按配方计算所需用量。其中玉米粉与黄豆粉需加水煮沸腾后计时20min，用68层纱布过滤，取滤液加入罐内。其它化学制剂加水溶解后直接加入培养基内即可。3.4培养基灭菌。打开启动开关，当温度达到100时，排气阀微开，温度达到121时自动计时40min。空气滤芯要提前另灭菌，此时可安装上，打开气泵吹干滤芯。在灭菌过程中，为避免阀门处成为灭菌死角，需要在保压过程中每隔15min排料一次，共3次，每次排料35min。3.5降温。灭菌结束后将夹层进水阀门打开通水冷却。在火焰的保护下将过滤器进气管接在培养器进气阀上，当培养器压力降至0.1MPa以下，进气系统气压高于罐内压0.02MPa以上时，打开进气阀向罐内送气。打开进气阀时要慢慢地，防止料液倒流，造成污染。罐内温度降至28以下时即可进行接种操作。3.6接种。接种时须两人配合操作。首先根据发酵罐接种口的大小用粗铁丝做一个圆圈，铁丝圈上包裹上脱脂棉，并用95%酒精浸湿备用。再备一条湿毛巾，放到接种口旁边（待熄灭火用）。接种方法：一是用75%酒精将接种口的外盖和周围擦两遍。二是开大排气阀，当罐压降到接近于零时，迅速关闭排气阀并点燃火圈。三是在火焰保护下，打开接种口盖，将摇瓶菌种迅速倒入罐内，旋紧接种盖。四是罐内升压后用湿毛巾灭掉火圈，打开排气阀，调整罐压在0.020.04MPa进入培养状态。3.7培养。根据食用菌品种生物学特性选择适合的培养温度。培养24h后，可每隔12h自接种阀取样一次，观察菌种萌发和生长情况。一是观察菌液颜色及透明度，正常菌液颜色纯正，一般呈现出浅黄色、浅棕色等不同颜色，澄清透明不浑浊。二是观察菌液气味，正常菌液有一种香甜味，若细菌污染有酸味、异味，霉菌污染有酒味。随着培养时间的延长，气味会越来越淡，到后期只有一种菌丝的香味无其它异味。4、液态发酵终点技术的确定食用菌发酵培养过程中细胞生长情况，遵循微生物生长曲线规律，可用细胞质量的增减来描述，即延迟期、对数生长期、减速期、稳定期、衰亡期。其中对数生长期的菌丝体生活力最旺盛，菌丝体相互缠绕形成各种形状的菌球，细胞数量呈几何级数增加，形成活力最旺盛的菌球，直径约0.3cm，发酵液中菌球颗粒约占80%90%，菌液颜色变淡透明，菌球与菌液界线分明，是放罐接种的最佳时期。若培养时间过长进入减速期之后，基质中营养物质被消耗，一些有害的代谢产物也在培养液中积累，菌丝由顶端生长开始分化成一些特定的繁殖器官，停止了细胞的继续延伸，甚至菌球内部菌丝开始死亡，从而影响栽培袋的接种成活率及产量。5、液态菌液杂菌预防措施食用菌液体菌种发酵采用纯种培养，要求除生产菌外无其它微生物。生产过程中一旦发生染菌，菌液将不能作为菌种使用，不但扰乱生产秩序，破坏生产计划，并且浪费大量原材料，造成经济损失。因此应当做好各种防护措施，树立以防为主，防重于治的观念，防止发酵染菌的发生，可从以下几个方面做到提前预防。5.1加强环境卫生管理，为发酵培养创造良好的环境条件。建立相应的操作规程和制度保障，培养具有一定专业素质的操作人员。5.2选用纯度高、菌丝健壮、生活力强的菌丝体做为种子。采用当年栽培的子实体进行组织分离，获得纯度高、色泽纯正的菌丝体做为母种，可将必要的传代次数降低到最低限度，减少衰退及突变机率的发生。5.3加强无菌操作观念。试管母种、一级种子、二级种子的转移与接种过程要严格按照无菌操作技术规程进行。5.4发酵罐是否正常。在使用前要检查各阀门是否开启灵活，管路连接是否有泄露，并及时处理。空气过滤器