实验一 溶菌酶的溶菌作用.doc

实验一 溶菌酶的溶菌作用实验目的：1、掌握溶菌酶对革兰氏阳性菌溶解的原理及应用。2、证实体液中溶菌酶的存在观察溶菌酶的溶菌现象。基本原理：正常情况下，机体的唾液、泪液、痰、鼻腔分泌物以及白细胞和血清等均含有丰富的溶菌酶。测定分泌物和体液中的溶菌酶含量及其变动情况，可作为评价机体非特异性免疫功能的指标之一。溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的- 1,4糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。 实验材料：1、葡萄球菌：本菌是一种革兰氏阳性菌，普通琼脂培养基生长良好。2、标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用蒸馏水配制为1000ug/ml原液，并稀释为100、50、10 ug/ml标准液，用前保存在冰箱中。 3、唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。（于饭后两小时，清水漱口3次，10分钟后，收集唾液于清洁烧杯中）；4、其它：无菌打孔器（孔径 2mm），无菌毛细吸管、毫米尺等。 实验方法：1、制备含葡萄球菌的琼脂平板 加热融化3%琼脂，冷至6070时，加入1ml葡萄球菌菌液，混合均匀，倾注于无菌平皿内。2、用无菌打孔器在葡萄球菌琼脂平板上打孔，孔径 2mm左右，孔距5-20mm。用针头挑出孔内琼脂， 3、用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加满唾液,同时加标准溶菌酶作阳性对照。 4、置 24-28下12-18h观察结果。观察各孔周围溶菌情况，测量溶菌环直径。实验结果：用毫米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对照作对比观察。 机体的免疫功能是由免疫系统完成的，免疫系统由免疫器官（中枢免疫器官和外周免疫器官），免疫细胞（T细胞（胸腺依赖性淋巴细胞）、B 细胞（骨髓依赖性淋巴细胞）、K 细胞、NK 细胞、LAK 细胞、TIL 细胞和单核巨噬细胞）和免疫分子（免疫球蛋白、补体、细胞因子等）等组成。（1）中枢免疫器官 胸腺：T 细胞分化成熟的场所。 骨髓：是多种血细胞的发源地，也是B 细胞、单核吞噬细胞、粒细胞、血小板和红细胞分化成熟的场所。法氏囊：禽类B 细胞分化成熟的场所。功能：是免疫细胞发生、分化和成熟的场所。 （2）外周免疫器官：淋巴结、脾脏和扁桃体、阑尾、肠壁集合淋巴结和消化道、呼吸道粘膜下层的淋巴小结。功能：是成熟的T、B淋巴细胞定居的场所，也是发生免疫应答的重要部位。免疫细胞：凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞统称为免疫细胞。包括：造血干细胞、淋巴细胞、单核吞噬细胞、粒细胞、红细胞。 免疫细胞泛指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及前体细胞，主要包括造血干细胞、T、B淋巴细胞、NK细胞、单核吞噬细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞、单核-巨噬细胞和树突状细胞。 免疫分子包括抗体、补体、细胞因子、主要组织相容性抗原和分化群等 。1、抗体(antibody，Ab)：免疫系统受抗原刺激以后，B细胞转化为浆细胞，由浆细胞产生能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白称抗体。它们与相应抗原特异性结合后，并在补体、吞噬细胞和NK细胞参与下，产生溶菌、促进吞噬杀菌的调理作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。2、补体（complement）：存在于人和动物的正常血清中，与免疫有关，具有酶活性的蛋白质。在生理状态下，补体各成分以酶原或非活性的状态存在与体液中，只有被某些物质(如抗原抗体复合物)激活后，才能表现出细胞溶解、促进吞噬的调理作用、免疫调节作以及释放炎症介质参与炎症反应等作用。3、细胞因子（cytokine，CK