流式检测多功能Th1细胞在结核感染中的应用.pdf

流式检测多功能流式检测多功能Th1Th1Th1Th1细胞在细胞在 结核感染中的应用结核感染中的应用 深圳市第三人民医院深圳市第三人民医院 深圳市肝病研究所深圳市肝病研究所 传染病研究中心传染病研究中心 张明霞张明霞 研究背景 Th1Th1Th1Th1细胞免疫及其分泌的细胞因子在结核病保护细胞免疫及其分泌的细胞因子在结核病保护 性免疫中起着必不可少的作用 结核菌抗原特性免疫中起着必不可少的作用 结核菌抗原特 异性异性IFN IFN IFN IFN 或分泌单一细胞因子或分泌单一细胞因子IFN IFN IFN IFN 的的Th1Th1Th1Th1细细 胞不能介导充分的免疫保护 其免疫水平与结胞不能介导充分的免疫保护 其免疫水平与结 核病免疫保护效果无相关性 而是对体内结核核病免疫保护效果无相关性 而是对体内结核 菌抗原量的反映 菌抗原量的反映 同时分泌同时分泌IL 2IL 2IL 2IL 2 IFN IFN IFN IFN 和和TNF TNF TNF TNF 的多功能的多功能Th1Th1Th1Th1细细 胞与结核疫苗诱导的保护性免疫密切相关 胞与结核疫苗诱导的保护性免疫密切相关 结核疫苗诱导的小鼠肺内保护性免疫依赖于肺结核疫苗诱导的小鼠肺内保护性免疫依赖于肺 组织内多功能组织内多功能Th1Th1Th1Th1细胞免疫的产生 细胞免疫的产生 多功能多功能Th1Th1Th1Th1细胞在人结核病保护性免疫中的作用细胞在人结核病保护性免疫中的作用 仍有待阐明 仍有待阐明 研究内容 探讨结核菌感染不同转归者外周血和肺内结核探讨结核菌感染不同转归者外周血和肺内结核 菌抗原特异性和非特异性多功能菌抗原特异性和非特异性多功能Th1 CD4 TTh1 CD4 TTh1 CD4 TTh1 CD4 T细细 胞存在的数量 比例 表型 及其与转归的相胞存在的数量 比例 表型 及其与转归的相 关性关性 探讨潜伏感染者和结核病人肺内探讨潜伏感染者和结核病人肺内 胸腔积液中多胸腔积液中多 功能功能Th1Th1Th1Th1免疫与特异性细胞免疫效应功能的关免疫与特异性细胞免疫效应功能的关 系 系 将新近结核菌潜伏感染者按照其测定的多功能将新近结核菌潜伏感染者按照其测定的多功能 Th1Th1Th1Th1免疫水平进行分类随访 观察其两年内结核免疫水平进行分类随访 观察其两年内结核 病发病率 建立多功能病发病率 建立多功能Th1Th1Th1Th1免疫与免疫保护的之免疫与免疫保护的之 间直接联系 间直接联系 非特异性多功能Th1细胞的检测 特异性多功能Th1细胞的检测 研究方法 流式细胞技术检测胞内细胞因子的方法 FCMFCM检测胞内细胞因子的方法特点检测胞内细胞因子的方法特点 单个细胞水平进行测定 能够分析产生特定细单个细胞水平进行测定 能够分析产生特定细 胞因子的细胞亚群及其表型特征胞因子的细胞亚群及其表型特征 简单 快捷 灵敏简单 快捷 灵敏 可直接反映体内细胞的状态可直接反映体内细胞的状态 实验结果客观实验结果客观 可反映细胞质中蛋白质的水平可反映细胞质中蛋白质的水平 FCMFCM检测胞内细胞因子的方法学原理检测胞内细胞因子的方法学原理 激活免疫细胞 激活激活免疫细胞 激活T T T T细胞 细胞 阻断胞内蛋白转运系统 阻断胞内蛋白转运系统 增加细胞膜通透性 增加细胞膜通透性 应用多色荧光标记抗细胞因子单克隆抗体 应用多色荧光标记抗细胞因子单克隆抗体 结合细胞表型测定与胞内细胞因子检测 结合细胞表型测定与胞内细胞因子检测 FCMFCM检测胞内细胞因子的操作程序检测胞内细胞因子的操作程序 非特异性刺激 非特异性刺激 PMA 50ng ml Ionomycin 1 PMA 50ng ml Ionomycin 1 PMA 50ng ml Ionomycin 1 PMA 50ng ml Ionomycin 1 g L g L g L g L 刺激刺激1 1 1 1 小小 时后时后 BrefeldinBrefeldinBrefeldinBrefeldin A 10 A 10 A 10 A 10 g ml g ml g ml g ml 特异性刺激 特异性刺激 MtbMtbMtbMtb裂解液裂解液 BCG 10ug mL BCG 10ug mL BCG 10ug mL BCG 10ug mL 非特异性刺激实验过程 250uL全血 750uL的完全1640刺激培养 PMA PMA PMA PMA IonomycinIonomycinIonomycinIonomycin 37 孵育1小时 加入BFA继续培养5小时 用PBS洗涤 2mL溶血素溶血固定10分钟后 PBS洗涤 用1mL破膜剂重悬细胞 室温避光40分钟 PBS洗涤 加入荧光标记抗体 室温避光30分钟 洗涤 1 PFA重悬细胞 流式细胞仪检测 结果分析 特异性刺激实验过程 分离PBMC 调细胞浓度1x106 mL 加Mtb BCG刺激 37 CO2孵育8小时 加入BFA继续培养6 8小时 用PBS洗涤 2mL溶血素溶血固定10分钟后 PBS洗涤 用1mL破膜剂重悬细胞 室温避光40分钟 PBS洗涤 加入荧光标记抗体 室温避光30分钟 洗涤 1 PFA重悬细胞 流式细胞仪检测 结果分析 1 1 1 1 非特异性多功能 非特异性多功能Th1Th1Th1Th1细胞的检测结果细胞的检测结果 CD3CD3CD3CD3 CD8CD8CD8CD8 TNF aTNF aTNF aTNF aTNF aTNF aTNF aTNF a CD3CD3CD3CD3 CD8CD8CD8CD8 55 555 555 555 5 12 412 412 412 421 821 821 821 8 10 310 310 310 3 35 535 535 535 548 248 248 248 2 3 03 03 03 013 213 213 213 2 0 70 70 70 718 418 418 418 4 3 33 33 33 377 677 677 677 6 4 24 24 24 244 144 144 144 1 3 23 23 23 248 548 548 548 5 33 233 233 233 29 89 89 89 8 17 917 917 917 939 139 139 139 1 4 24 24 24 255 555 555 555 5 4 34 34 34 36 76 76 76 7 1 41 41 41 43 03 03 03 0 9 39 39 39 386 386 386 386 3 6 56 56 56 560 060 060 060 0 7 17 17 17 126 426 426 426 4 49 349 349 349 37 17 17 17 1 25 025 025 025 018 518 518 518 5 39 039 039 039 049 549 549 549 5 6 56 56 56 55 05 05 05 0 19 819 819 819 8 26 426 426 426 452 852 852 852 8 1 01 01 01 0 17 617 617 617 618 418 418 418 4 18 418 418 418 445 645 645 645 6 TBTBTBTBLTBILTBILTBILTBIHDHDHDHD IFN rIFN rIFN rIFN r IL 2IL 2IL 2IL 2 P IP IP IP I 非特异性刺激非特异性刺激 0 0 0 0 10101010 20202020 HD LTBI TB IL 2 TNF IFN CD4 T cellCD4 T cellCD4 T cellCD4 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 00 00 00 0 2 52 52 52 5 5 05 05 05 0 HD LTBI TB IL 2 TNF IFN 10101010 20202020 30303030 40404040 50505050 CD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression A B 流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL 2 TNF a IFN r表达 A 90 例健康对照 HD 108例潜伏感染者 LTBI 111例结核患者 TB B 10例健康对照 6例潜伏感染者 28例结核患者 0 0 0 0 10101010 20202020 AFB AFB IL 2 TNF IFN CD4 T cellCD4 T cellCD4 T cellCD4 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 0 0 0 25252525 50505050 75757575 AFB AFB IL 2 TNF IFN CD8 T cellCD8 T cellCD8 T cellCD8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression AB 流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL 2 TNF a IFN r表达 A 55例痰涂片阴性 AFB 结核患者 36例痰涂片阳性 AFB 结核 患者 B 23例痰涂片阴性结核患者 2例痰涂片阳性结核患者 0 5 10 15 20 PTB TP IL 2 TNF IFN CD4 T cell cytokine expression 0 0 0 0 10101010 20202020 30303030 40404040 50505050 PTB TP IL 2 TNF IFN CD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 0 0 0 5 5 5 5 10101010 15151515 20202020 25252525 PBMC PFMC IL 2 TNF IFN CD4 T cellCD4 T cellCD4 T cellCD4 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 0 0 0 10101010 20202020 30303030 40404040 50505050 60606060 PBMC PFMC IL 2 TNF IFN CD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression A B C D 流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL 2 TNF a IFN r表达 A 79例肺结核 PTB 患者 20例结核性胸膜炎 TP 患者 B 9例肺结核患者 8例结核性胸膜炎患者 C 11例外周血 PBMC 与胸水 PFMC 对应患者 D 16例外周血 PBMC 与胸水 PFMC 对应患者 2 特异性多功能Th1细胞的检测结果 CD3CD3CD3CD3 CD8CD8CD8CD8 TNF aTNF aTNF aTNF a CD3CD3CD3CD3 CD8CD8CD8CD8 TNF aTNF aTNF aTNF a 75 075 075 075 019 419 419 419 4 5 65 65 65 60 0 0 0 0 10 10 10 199 699 699 699 6 0 0 0 00 30 30 30 3 0 10 10 10 1 99 899 899 899 8 0 0 0 0 0 10 10 10 1 57 157 157 157 114 314 314 314 3 28 628 628 628 60 0 0 0 TBTBTBTBLTBILTBILTBILTBIHDHDHDHD 18 518 518 518 5 19 019 019 019 010 710 710 710 7 51 751 751 751 7 0 40 40 40 4 98 898 898 898 8 0 50 50 50 5 0 30 30 30 3 16 716 716 716 713 013 013 013 0 13 013 013 013 057 457 457 457 4 98 598 598 598 5 0 70 70 70 7 0 0 0 00 80 80 80 8 IFN rIFN rIFN rIFN r IL 2IL 2IL 2IL 2 0 80 80 80 80 0 0 0 99 199 199 199 1 0 10 10 10 1 0 0 0 0 89 889 889 889 8 6 46 46 46 43 83 83 83 8 4 64 64 64 678 978 978 978 9 6 46 46 46 410 010 010 010 0 0 10 10 10 1 99 699 699 699 6 0 0 0 0 0 30 30 30 3 MtbMtbMtbMtb 特异性刺激特异性刺激 0 00 00 00 0 0 10 10 10 1 0 20 20 20 2 0 30 30 30 3 0 40 40 40 4 0 50 50 50 5 0 60 60 60 6 0 70 70 70 7 0 80 80 80 8 HD LTBI TB 2 52 52 52 5 7 57 57 57 5 12 512 512 512 5 IL 2 TNF IFN CD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 000 000 000 00 0 250 250 250 25 HD LTBI TB IL 2 TNF IFN 0 40 40 40 4 1 41 41 41 4 CD 4 T cellCD 4 T cellCD 4 T cellCD 4 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression AB 流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL 2 TNF a IFN r表达 A 34 例健康对照 HD 19例潜伏感染者 LTBI 28例结核患者 TB B 34例健康对照 19例潜伏感染者 26例结核患者 0 00 00 00 0 0 20 20 20 2 0 40 40 40 4 AFB AFB 0 50 50 50 5 1 31 31 31 3 2 12 12 12 1 2 92 92 92 9 IL 2 TNF IFN CD4 T cellCD4 T cellCD4 T cellCD4 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 00 00 00 0 0 50 50 50 5 1 01 01 01 0 AFB AFB 2 2 2 2 12121212 IL 2 TNF IFN CD8 T cellCD8 T cellCD8 T cellCD8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression AB 流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL 2 TNF a IFN r表达 A 17例痰涂片阴性 AFB 结核患者 5例痰涂片阳性 AFB 结核 患者 B 17例痰涂片阴性结核患者 5例痰涂片阳性结核患者 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3PTB TP IL 2 TNF IFN CD4 T cellCD4 T cellCD4 T cellCD4 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 PTB TP 10101010 20202020 30303030 IL 2 TNF IFN CD8 T cellCD8 T cellCD8 T cellCD8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 PBMC PFMC IL 2 TNF IFN 6 6 6 6 16161616 26262626 36363636 CD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 0 0 0 0 1 1 1 1 PBMC PFMC IL 2 TNF IFN 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6 CD 4 T cellCD 4 T cellCD 4 T cellCD 4 T cell cytokine expression cytokine expression cytokine expression cytokine expression 流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL 2 TNF a IFN r表达 A 14例肺结核 PTB 患者 10例结核性胸膜炎 TP 患者 B 9例肺结核患者 10例结核性胸膜炎患者 C 6例外周血 PBMC 与胸水 PFMC 对应患者 D 7例外周血 PBMC 与胸水 PFMC 对应患者 3 肺泡灌洗液多功能Th1细胞检测 30 730 730 730 7 23 523 523 523 5 40 440 440 440 4 3 23 23 23 255 455 455 455 4 10 210 210 210 2 20 220 220 220 2 0 50 50 50 5 78 578 578 578 520 320 320 320 3 38 538 538 538 5 8 28 28 28 2 A A A A PMA InomyPMA InomyPMA InomyPMA Inomy cincincincin刺激刺激 17 717 717 717 7 17 917 917 917 9 32 532 532 532 5 8 68 68 68 6 9 69 69 69 6 32 832 832 832 8 53 453 453 453 4 15 115 115 115 1 17 317 317 317 328 628 628 628 6 31 931 931 931 9 1 91 91 91 9 B B B B MtbMtbMtbMtb刺激刺激 4 多功能Th1细胞与Th17的相关性 HD LTBI TBHD LTBI TBHD LTBI TBHD LTBI TB 0 0 0 0100010001000100020002000200020003000300030003000 0 00 00 00 0 2 52 52 52 5 5 05 05 05 0 7 57 57 57 5 10 010 010 010 0 r 0 6147 P 0 0001 MutiTh1MutiTh1MutiTh1MutiTh1 IL 17 CD4 IL 17 CD4 IL 17 CD4 IL 17 CD4 BCG HD LTBI TBBCG HD LTBI TBBCG HD LTBI TBBCG HD LTBI TB 0 0 0 0100010001000100020002000200020003000300030003000 0 00 00 00 0 2 52 52 52 5 5 05 05 05 0 7 57 57 57 5 10 010 010 010 0 r 0 5287 P 0 0001 MutiTh1MutiTh1MutiTh1MutiTh1 IL 17 CD4 IL 17 CD4 IL 17 CD4 IL 17 CD4 MutiTh1MutiTh1MutiTh1MutiTh1与与IL 17IL 17IL 17IL 17相关性相关性 MutiTh1MutiTh1MutiTh1MutiTh1与与IL 17IL 17IL 17IL 17相关性相关性 HD