大肠杆菌感受态细胞的制备和转化ppt课件.ppt

实验九 十大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 1 在自然条件下 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内 但在人工构建的质粒载体中 一般缺乏此种转移所必需的mob基因 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移 如需将质粒载体转移进受体细菌 需将对数生长期的细菌 受体细胞 经理化方法处理后 细胞膜的通透性发生暂时性改变 成为能允许外源DNA分子进入的细胞 称感受态细胞 一 实验原理 1 概念 感受态细胞 转化 Transformation 是将外源DNA分子引入受体细胞 使之获得新的遗传性状的一种手段 它是微生物遗传 分子遗传 基因工程等研究领域的基本实验技术 转化 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 R M 它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代 受体细胞经过一些特殊方法 如电击法 CaCl2 RbCl KCl 等化学试剂法 的处理后 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变 成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 Compenentcells 进入受体细胞的DNA分子通过复制 表达实现遗传信息的转移 使受体细胞出现新的遗传性状 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养 即可筛选出转化子 Transformant 即带有异源DNA分子的受体细胞 转化 转化过程 RbCl KCl 法 CaCl2法 电击感受态制备等RbCl KCl 法制备的感受态细胞转化效率较高 但制备较复杂 不适合实验室用电击感受态细胞转化效率高 操作简便 但需电击仪CaCl2法简便易行 且其转化效率完全可以满足一般实验的要求 制备出的感受态细胞暂时不用时 可加入占总体积15 的无菌甘油于 70 以下保存半年 因此CaCl2法使用更为广泛 常用的感受态细胞制备方法 CaCl2法是以Mendel和Higa 1970 的发现为基础 其基本原理是 细胞处于0 4 CaCl2低渗溶液中 大肠杆菌细胞膨胀成球状 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物粘附于细胞表面 经42 90秒热激处理 促进细胞吸收DNA混合物 将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间 促使在转化过程中获得的新的表型 如氨苄青霉素耐药 Ampr 得到表达 然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上 倒置培养过夜 即可获得细菌菌落 CaCl2法制备感受态细胞原理 提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度质粒的质量和浓度试剂的质量防止杂菌和杂DNA的污染 细胞生长状态和密度 不要用经过多次转接或储于 的培养菌 最好从 70 或 20 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好 可通过监测培养液的OD600来控制 DH5 菌株的OD600为0 5时 细胞密度在5 107个 ml左右 不同的菌株情况有所不同 这时比较合适 密度过高或不足均会影响转化效率 提高转化效率的几个因素 质粒的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA cccDNA 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比 但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时 转化效率就会降低 1ng的cccDNA即可使50 l的感受态细胞达到饱和 一般情况下 DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5 提高转化效率的几个因素 试剂的质量 所用的试剂 如CaCl2等均需是最高纯度的 GR 或AR 并用超纯水配制 最好分装保存于干燥的冷暗处 防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行 所用器皿 如离心管 tip头等最好是新的 并经高压灭菌处理 所有的试剂都要灭菌 且注意防止被其它试剂 DNA酶或杂DNA所污染 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入 为以后的筛选 鉴定带来不必要的麻烦 提高转化效率的几个因素 1 材料E coliDH5 菌株 pBS质粒 1 5ml离心管 又称eppendorf管 Amp 2 设备恒温摇床 电热恒温培养箱 台式高速离心机 超净工作台 低温冰箱 恒温水浴锅 制冰机 分光光度计 微量移液枪 eppendorf管等 二 材料 设备及试剂 0 1mol L的CaCl2LB液体培养基LB固体培养基Amp母液 氨苄青霉素 Ampicillin Amp 母液 配成100mg ml水溶液 20 保存备用 3 试剂 三 操作步骤 本实验以E coliDH5a菌株为受体细胞 并用CaCl2处理 使其处于感受态 然后与质粒共保温 实现转化 由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因 Ampr 可通过Amp抗性来筛选转化子 如受体细胞没有转入质粒 则在含Amp的培养基上不能生长 能在Amp培养基上生长的受体细胞 转化子 肯定已导入了质粒 转化子扩增后 可将转化的质粒提取出 进行电泳 酶切等进一步鉴定 受体菌的培养1 从LB平板上挑取新活化的E coliDH5 单菌落 接种于3 5mlLB液体培养基中 37 180rpm振荡培养过夜 2 将该菌悬液以1 30 100的比例接种于100mlLB液体培养基中 37 振荡培养2 3小时至OD600在0 3 0 4左右 3 无菌条件下取1 5ml菌液到eppendorf管中 冰浴10min 4 8000rpm离心5min 4 彻底弃上清液 在冰浴上加入500ul预冷的无菌CaCl2 0 lmol L 使细胞悬浮 5 4 8000rpm离心4min 弃上清液 4 5步可重复1 2次 6 用100 l预冷的无菌CaC12 0 lmol L 重新悬浮细胞 冰上备用 注 如果需要保存 用80ul预冷的无菌CaC12 O lmol L 和20ul无菌的70 甘油悬浮细胞 液氮冷激10min后 70 以下保存备用 2 转化 取100 l感受态细胞悬液 在冰浴中使其解冻 加入10 l连接产物 或质粒DNA 含量不超过50ng 体积不超过10 l 轻轻摇匀 冰上30 40min A 质粒DNA组 10 lpBS质粒DNA 100 l感受态细胞悬液B 空白对照组 10ul无菌水 100 l感受态细胞悬液 42 水浴中热击90秒 勿摇动 热击后迅速置于冰上冷却2min 向管中加入400 LLB液体培养基 不含Amp 混匀后37 180rpm振荡培养40min 使细菌恢复正常生长状态 并表达质粒编码的抗生素抗性基因 Ampr 涂平板 将上述菌液摇匀后取100ul涂布于含Amp的筛选平板上 在菌液完全被培养基吸收后 37 倒置培养皿培养12 16h 注意 1 含Amp的LB固体培养基的配制 将灭菌的LB固体培养基水浴溶解后冷却至60 左右 加入Amp储存液 使终浓度为50 100ug ml 摇匀后倒平板 2