沙门菌检查.1doc.doc

山东聊城阿华制药有限公司SOP-UIS 06 00Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD 山东聊城阿华制药有限公司标准操作程序检验SOP控制菌检查沙 门 菌编 码SOP-UIS 06 00起草人日 期审核人日 期批准人日 期实施日期版 次011 简述沙门属是肠杆菌科的重要致病菌，药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每10g（或10ml）药品中是否检出沙门菌作出检验报告。由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的沙门菌受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌。然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。2 仪器、设备及用具（参见大肠埃希菌2）。3. 试液、指示液（参见大肠埃希菌3）。3.1 无菌脲试液。3.2 酚磺酞指示液。3.3 亮绿试液。3.4氰化钾试液3.5 溴甲酚紫指示液3.6革兰染色液4.培养基4.1营养琼脂培养基。4.2营养肉汤培养基。4.3半固体营养琼脂培养基。4.4曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）。4.5麦康凯琼脂培养基（MacC）。4.6四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）。4.7三糖铁琼脂培养基（TSI）。4.8胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）。4.9沙门菌属志贺菌属琼脂培养基（SS）。4.10蛋白胨水培养基。4.11脲（尿素）琼脂培养基。4.12氰化钾培养基。4.13赖氨酸脱羧酶培养基。5.对照用菌液取乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，361培养1824h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106（浓度相当于50100cfu/0.1ml），作阳性对照用菌液。其菌液浓度可用平板菌落计数法测得。即取0.1ml加入平皿内，倾注营养琼脂，混匀，或以0.1ml均匀涂布于事先准备好的营养琼脂平板上，经培养后点计求得。6.操作方法6.1准备工作：（见细菌、霉菌和酵母菌计数6）。6.2供试液的制备：（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）。6.3阳性对照试验、阴性对照试验（见大肠埃希菌7.1）。6.4增菌培养6.4.1预增菌 取营养肉汤培养基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供试品混匀，另1份加入稀释剂10ml作阴性对照，361培养1824h，观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长。6.4.2增菌培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶，吸取1ml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养1824h。6.5分离培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶，以接种环沾取12环培养液划线于胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门菌志贺菌琼脂（SS）平板及曙红亚甲蓝（EMB）琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养2448h，必要时延长至4048h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。沙门菌在上述平板上的菌落形态见下表沙门菌的菌落形态特征培养基菌 落 形 态胆盐硫乳琼脂（DHL）无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。沙门菌属志贺菌属琼脂（SS）无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。曙红亚甲蓝琼脂（EMB）无色至浅橙色，半透明或透明，光滑湿润的圆形菌落。麦康凯琼脂（MacC）无色至浅橙色，半透明或透明，菌落中心有时为暗色。 6.6初步鉴别试验从每个供试品的分离平板上挑取23个疑似菌落分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养1824h，观察结果。疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：（1）斜面红色（产碱），底层黑色（产H2S）并显示黄色（产酸）。（2）斜面红色，底层黄色。（3）斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验，血清凝集试验及革兰染色，镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。6.7生化试验6.7.1靛基质试验 用接种环沾取少许培养物，接种于蛋白胨水培养基中，照大肠埃希菌靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。6.7.2脲酶试验 用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养24h，观察结果。斜面变为红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应。6.7.3氰化钾试验 将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养2024h，用接种环沾取培养液一环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养2448h，观察结果。对照管内有菌生长（混浊），而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长（混浊）而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。6.7.4赖氨酸脱羧酶试验 用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养2448h观察结果。对照管黄色（产酸），试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱)；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。6.7.5动力试验 用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h，观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状；无动力表现的培养物，应在室温保留23天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动，动力试验阳性。6.8血清学凝集试验6.8.1 准备1片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径3mm接种环沾取沙门菌属O多价血清23环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹，长约1.5cm，宽约0.5cm。另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴性对照。6.8.2用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面新鲜培养物少许，在血清和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。6.8.3将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，阴性对照不出现凝集现象，试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，约20min，再观察结果。如果仍然没有出现凝集，应取斜面培养物，置含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在100水浴中保温30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷，再做凝集试验，如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应。6.8.4如对照试验出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验。7结果判定7.1供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应。多价1血清凝集试验阳性反应（含待检培养物经10030min处理后凝集试验为阳性反应），报告10g或10ml供试品检出沙门菌。7.2供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应。多价1血清凝集试验为阴性反应（含待检培养物经10030min处理后凝集试验为阴性反应），报告10g或10ml供试品未