（微生物学专业论文）一株产碱性磷酸酶菌株的分离鉴定及发酵条件研究.pdf

致萱f 本论文是在导师贾小明副教授的悉心指导下完成的 从论文的选 题 技术路线设计和最后整理成文 都倾注了她大量的心血 贾老师 渊博的学识 严谨的治学 一丝不苟的工作作风 开拓创新的学者风 范及为人师表的高尚人格给了我莫大的启迪和教诲 在此 谨向我的 导师表示衷心的唐谢和最诚挚的谢意 在论文的完成过程中 得到了浙江大学马晓航副研究员 赵宇华 教授给予的热情帮助和指点 在此对他们表示忠心 的唐谢 此外 藏谢我的师兄周学来 程天凡 朱亚伟 师姐杨丽 郭康 平博士 李霞博士 林晓燕博士等同学 师妹徐晓红 师弟赵伟峰 开雷以及实验室的郭桂枝 孔素英两位阿姨给我的热心啼助 是他们 营造了良好t 绮o i 究气氛和学习环境 使我度过了非常愉快的三年硕士 生学习时光 值此论文完成之际 特别唐激深爱我的父母和家人 唐谢他们多 年来对我的养育和教导之恩 庄百川 2 0 0 6 年8 月于华家池 浙江大学硕士学位论文 一株产碱性磷酸酶菌的分离 鉴定及发酵条件研究 摘要 碱性磷酸酶 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e e c 3 1 3 1 简称a l p 是一 种底物专一性较低的 裂解有机磷化合物释放无机磷的磷酸单脂酶 确l 生磷酸酶 在酶联免疫测定 生物传感器 非同位素探针 杂交和测序方面有广泛应用 在 分子生物学方面 碱性磷酸酶分解核酸的末端磷酸盐 是遗传工程的有用工具酶 碱性磷酸酶还在有机磷农药降解中起到非常重要的作用 碱性磷酸酶主要存在于人体 动物 植物和微生物中 目前商业碱性磷酸酶 大多产自动物体 小牛肠碱性磷酸酶 或植物体 麦芽 产率低 价格昂贵 有些热稳定性差 使它的使用受到了限制 为了获得具有自主产权的产率高 热 稳定性好的碱性磷酸酶 本研究从3 2 株细菌中分离筛选到一株热稳定性较好的 产碱性磷酸酶的菌株h b l 对其进行了鉴定 并进一步研究了该菌株的产酶条件 主要实验结果如下 1 产碱性磷酸酶茵株的分离 筛选从土壤分离的 1 2 株 和浙江大学应用 微生物学研究室已有保存菌株 2 0 株 共3 2 株茵中用微孔板法初筛 获得三株 碱性磷酸酶活性较高的菌株h b i 1 b 7 磷酸苯二纳法测酶活复筛后确定菌株 h b l 产酶活性最高 该菌株主要产胞外碱性磷酸酶 并发现该酶具有较好的热稳 定性 2 产酶茵株的鉴定通过对菌株h b i 的形态学观察 生理生化特性测定 d n a 中g cm 0 1 含量 1 6 sr d n a 测序和比对分析 确定菌株t i b l 属于芽胞杆菌属 b a c i l l u s s p 的一个种 3 菌株h b l 产酶发酵条件的优化用摇瓶批量发酵法测得h b l 发酵的最佳培 养基为 葡萄糖 6 9 酵母粉 8 9 m g s o 7 h 2 0 0 5 9 n a c l i g 水 1 0 0 0 m l p h7 5 最适培养条件为 培养温度3 0 3 装液量为l o o m l 三角瓶装2 5 m l 培养 液 于1 2 0 r p m 转速下培养2 4 h 在此条件下 发酵上清液酶活性可迭2 2 5u m l 本研究分离到的产酶菌株为发酵生产碱 1 生磷酸酶提供了微生物资源 优化发 酵试验结果为利用该茵发酵生产碱性磷酸酶提供了实验室小试参数 关键词 碱性磷酸酶 鉴定 分离 发酵条件 芽胞杆菌 浙江大学硕士学位论文 s t u d i e so ni s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fa na l k a l i n e p h o s p h a t e s p r o d u c i n gb a c t e r i u ma n di t sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s z h u a n gb a i c h u a n c o l l e g eo f l i f es c i e n c e z h c j i a n gu n i v e r s i t y h a n g z h o u c h i n a 3 1 0 0 2 9 a b s t r a c t a l k a l i n e p h o s p h a t a s c e c 3 1 3 1 i sal o w e r s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y p h o s p h o m o n o s t e m s et h a td e g r a d eo r g a n o p h o s p h o r u sc o m p o u n d st o r e l e a s ef r c c i n o r g a n i cp h o s p h a t e a l k a l i n ep h o s p h a t a s ci su s e dw i d ea p p l i c a t i o ni ne n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y e l i s a s y s t e m s b i o o g i c a l 鸵n s o n o n i s o t o p i cp r o b i n g b l o t t i n ga n ds e q u e n c i n gs y s t e m s i nm o l e c u l a rb i o l o g y a l k a l i n ep h o s p h a t a s cc a n b r e a k d o w ne x 血c m cp h o s p h a t e a n di sau s e f u lt o o le n z y m ei ng e n e t i ce n g i n e e r i n g a l k a l i n ep h o s p h a t a s ea l s op l a y smi m p o r t a n tr o l ei no r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s b i o d e g r a d a t i o m a l k a l i n ep h o s p h a t a s ee x i s t si nh u m a n a n i m a l p l a n ta n dm i c r o o r g a n i s m s of a r c o m m e r c i a la l k a l i n ep h o s p h a t a s ec o m e sf r o mm a i n l ya n i m a l c a l f i n t e s t i n a l 0 1 p l a n t w h e a tg e r m h o w e v e r a l k a l i n ep h o s p h a t a s eo fa n i m a lo rp l a n tu s e f u l n e s si sl i m i t e d b yt h e i ri n h e r e n t l yl o wt h e r m o s t a b i l i t ya n dl o wp r o d u c t i v i t y i no r d e r t og e ta l pw i m l l i g hp r o d u c t i v er a d i oa n dg o o dt h e r m o s t a b i l i t y as t r a i no fb a c t e r i ac a p a b l eo f p r o d u c i n ga l k a l i n ep h o s p h a t a s ew a si s o l a t e df m m3 2s t r a i n so fb a c t e r i a a n dw a s i d e n t i f i e ds u b s e q u e n t l y t h ec o n d i t i o n so ft h ee n z y m ef e r m e n t a t i o nw e r ec a r r i e do u t i nt h i ss t u d y t h er e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s 1 t h ei s o l a t i o na n ds c r e e n i n go f t h ep r o d u c i n ga l k a l i n ep h o s p h a t a s es t r a i n w i t hm i e n w e l lp l a t sm e t h o d w es e l e c t e dt h r e es t r a i i 坞h b l l 撑 b 7a m o n g 3 2b a c t e r i as t r a i n s 1 2s t r a i n sw 黜i s o l a t e df r o ms o i l o t h e r2 0s t r a i n sg o tf r o m o u rs t m i mb a n k w h i c hs h o w e dh i g h e ra l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t i e s f r o m t h r e es t 明i 1 1 s s t r a i nh b lh a dt h eh i g l l e s ta l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t i e sb yt h e s e c o n ds c r e e n i n gt e s t i tw a sf o u n dt h a ts w a i nh b ie x c r e t e dc x t r a c e l l u l a r a l k a l i n ep h o s p h a t a s ew i t hg o o dt h e r m o s t a b i l i t y 2 t h ei d e n t i f i c a t i o no f t h ep r o d u c i n ga l k a l i n ep h o s p h a t a s es t r a i n 2 浙江大学硕士学位论文 o nt h eb a s i so fs t r a i nh b ln l o f p h o i o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n dg c m 0 1 o fd n aa sw e l la s1 6 sr d n as e q u e n c ea n db l a s ta n a l y s i s t h i s n e wi s o l a t eb e l o n g st ob a c i l l u ss p 3 o p t i m a lc o n d i t i o n sf o ra l k a l i n ep h o s p h a t a s ep r o d u c e db ys t r a i nh b i b a s e do nt h es t u d i e si nt h ec o n d i t i o n so fe 1 1 z y l r l ep r o d u c t i o n t h eo p t i m a l f a r m c n t a t i o nc o n d i t i o nw a se s t a b l i s h e d t h ec o m p o s i t i o n so ft h em e d i u mw e r e g l u c o s e6 9 y e a s tp o w d e r8 9 m g s 0 4o 5 9 n a c ll g i i o1 0 0 0 m la n dp h7 5 w h e nt h ec e l l so fs t a i nh b lw a si n o c u l a t e di na1 0 0m lf l a s kc o n t a i n i n g2 5m l m e d i u ma n di n c u b a t e do nas h a k e ro f1 2 0r p ma t3 0 cf o r2 4h t h e a l k a l i n ep h o s p h a t a s ea c t i v i t yi ni t sc e l l f r e es u p e r n a t a n tp e a k e da t2 2 5 u m 1 i nt h i ss t u d y as t r a i nh b io fb a c t e r i ac a p a b l eo fp r o d u c i n ga l k a l i n e p h o s p h a t a s ew a si s o l a t e da n ds u p p l i e sm i c r o b i a lr e s o u r c e s t oe n z y m a t i ci n d u s t r y t h er e s u l to ft h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ss u p p l i e sl a b o m t o wp a i m n c t c r sf o r i n d u s t r yp r o d u c t i o no f a l k a l i n ep h o s p h a t a s e k e y w o r d s a l k a l i n el h o s p h a t a s e i d e n t i f y i s o l a t i o n z y m o j y t i cc o n d i t i o n s b a 觑s s p 3 浙江大学硕士学位论文 第一章微生物源碱性磷酸酶的研究 文献综述 碱性磷酸酶 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e e c3 1 3 1 简称a l p 是一种底物 专一性较低的磷酸单脂酶 在酶联免疫测定 非同位素探针 生物传感器 标记 和测序方面有着重要的用途 在分子生物学中 a l p 分解核酸的末端磷酸盐 是 遗传工程常用的工具酶 近年来 碱性磷酸酶生物传感器的研究引起了越来越多 的重视 它不但能传递信息 还可以放大信息 比如离子色谱仪结合a l p 生物 传感器可以测定本来不能测定的物质 碱性磷酸酶还是有机磷农药降解酶之一 在有机磷污染物降解治理中起到非常重要的作用 此外有报道 添加a l p 到药用 化妆品有益于皮肤细胞的再生和新成代谢 p o s e n s 1 9 6 7 因此a l p 被广泛用 于分子生物学研究 医学l 缶床检验以及环境毒物检测中 许多生物体可产生碱性磷酸酶 该酶在生物体内直接参与磷酸基团的转移和 代谢过程 产自动植物体的碱性磷酸酶由于产率低 热稳定性差等使其的使用受 到了限制 而从微生物中筛选分离高产适用的碱性磷酸酶越来越受到人们的关注 f e r l e y h n m a m m a lj a n 1 9 7 1 1 1 碱性磷酸酶的测定方法 1 1 1 对硝基磷酸苯二钠法 碱性磷酸酶在碱性的环境下作用于对硝基磷酸苯二钠 p n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e 缩写 n p p 使之水解释放出对硝基苯酚和磷酸 对硝基苯酚呈黄色 在4 0 5 咖处有吸收峰 根据吸光值即可推算出碱性磷酸酶 的活性 o n a l磷酸酶 n q r 一小p 0 呻 一r 0 i i n a 2 h p o l l h o o n a 1 1 2 磷酸苯二钠法 碱性磷酸酶在碱性的环境下作用于磷酸苯二纳 使之水解释放出酚和磷酸 4 浙江大学硕士学位论文 酚在碱性溶液中与4 一氨基安替比林作用 经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物 用分光光度计a 5 比色法测定a l p 的活力 钱士匀 2 0 0 4 o n a l磷酸酶 苯 o p 0 酚 n 枷p 0 啪 o n a 1 1 3 化学发光检测法 1 9 9 5 年日本s a s a m o t o 等人 h i d c h i k os a s a m o t oe ta 1 9 9 5 合成了苯甲酰 甲基磷酸盐 p h e n a c y lp h o s p h a t e 它在a l p 的催化下可以生成苯甲酰甲醇 p h e n a y c y la l c o h 0 1 而苯甲酰甲醇则可以和光泽精 l u c i g e n i n 反应产生 强烈的化学发光 检测器可以非常灵敏地检测化学发光 我们可以根据发光强度 来确定a l p 的活力 化学发光检测法灵敏度高 最小检测量可达皮克级 选择 性好 1 1 4 戈氏钙一钴法 碱性磷酸酶水解甘油磷酸后释放出无机磷酸盐 经钙离子作用生成磷酸钙 其与钴离子作用生成磷酸钴 最后与硫酸胺生成黑色硫化钴颗粒沉淀 可以根据 硫化钴的多少来确定a l p 的活力 l 1 5b c i p n b t 比色法测定碱性磷酸酶活力 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚磷酸盐 b c i p 和氯化硝基四氮唑蓝 n b t 在a l p 作用下生 成靛蓝自 i n d i g o w h i t e 和双甲躜 d i f o r m a z a n 双甲躜呈蓝褐色 可供比色 陈 国千 1 1 6h n p 4 羟基一萘一1 一磷酸 安培电流计法测定碱性磷酸酶活力 m a rm a s s a n 等人 m d rm d s s o ne ta 1 1 9 9 9 合成一种新的碱性磷酸酶底物 h n p 4 一羟基一萘一1 一磷酸 并结合安培电流计法来测定a l p 活力 此法灵敏度极高 如图1 i 所示 h n p 在a l p 作用下生成d h n 而还原性很强的d h n 极易被空气氧化为 n q 在一3 0 0 m v f 吸牧2 个h 交回d h n 在这个过程中安培电流计变可以测定d h n 生成的数量 从而判定a l p 的活性 5 浙江大学硕士学位论文 h h p 洲n 图1 1 以4 一羟基一萘一1 磷酸为底物的安培电流计法测定碱性磷酸酶活力的反应图 f i g 1 1r e a c t i o ns c h e mf o rt h ee a p e r o a e t r i cd e t e c t i o no fa l k a l i n ep h o s p h a t m a c t i v i t y i t h 肿 b s t m t e 1 1 7 几种酶检测方法的比较 以上几种测定碱性磷酸酶活力的方法中 戈氏钙一钴法是测定底物解离下来 的游离磷酸根来计算酶活性 这种方法受样品本身有磷酸根及磷酸化的缺点现已 逐步被淘汰 化学发光检测法和刖p 4 一羟基一萘一1 一磷酸 安培电流计法由于检 测仪器条件及重复性问题 在我国尚不能普及 目前实验室常用的测定方法是n p p 法和磷酸苯二钠法 n p p 法的步骤简单 在外文刊物上也较为常见 但这种方法 也有缺点 首先 国产n p p 试剂目前质量尚未达到要求 测定结果不稳定 而进 k i n p p 试剂定购周期长价格高 磷酸苯二钠法虽然步骤略微繁琐 但试剂廉价 产生的红色醌类化合物也不会受到培养基颜色的干扰 测定结果稳定 所以 本试验采用磷酸苯二钠法作为测定方法 1 2 产碱性磷酸酶的微生物 1 2 1 大肠杆菌 e s c h e r i c h i ac o l i 产生的碱性磷酸酶 6 浙江大学硕士学位论文 已经报道了很多种微生物可以产生碱性磷酸酶 最早发现产碱性磷酸酶的微 生物是e s c h e r i c h i ac o l i h o r i u c h i te ta 1 1 9 5 9 作为碱性磷酸酶的模 型 f a p ec o l ia l k a l i n ep h o s p h a t a s e 是研究最透彻的碱性磷酸酶 大量点 突变阐明了许多氨基酸的结构功能 k a r a m y s h e v 1 9 9 8 与哺乳动物碱性磷酸酶 相比 e a p 具有很高的热稳定性 但相对活力较低 m a n d e c k ie ta l 1 9 9 1 f a p 是z n 金属酶 分子量为8 0 0 0 0 由两个相同的亚基组成 k m l m m 最佳 p h 值为1 0 e a p 存在于ec o l i 的周质空间 1 2 2 嗜热细菌产生的碱性磷酸酶 1 2 2 1 那不勒斯栖热袍菌 t h e o t o g an e a p o l i t a n a 那不勒斯栖热袍菌 t h e r m o t o g a n e a p o l i t a n a 是一种嗜热的真细菌 能生 活在8 0 1 3 以上的环境中 该菌可以产生热稳定性极强的t a p zn e a p o l i t a n a a l k a l i n ep h o s p h a t e a s e 它的分子量大约是8 7 0 0 0 它是一种金属酶 在e d t a 的作用之下 t a p 会失去9 5 的活力 但是与其他a l p 不同 c o 可以将酶活提 高2 倍并同时增强酶的热稳定性 该酶的最适p h 是9 9 最适反应温度为8 5 这类生物产生的酶具有极高的热稳定性 这一点引起了研究人员的广泛关注 d o n g e ta 1 1 9 9 7 1 2 2 2 古热球菌 巧 n d o d c c m 4 劬耐 产生的碱性磷酸酶 s e b a s t i e nz a p p a 在深海的火山口附近分离出一种产碱性磷酸酶的古热球 菌 该菌的特点是具有极高的热稳定性 能在1 0 0 c 保持酶活 s 6 b a s t i e nz a p p a p a 1 2 0 0 1 其他能产生的碱性磷酸酶的嗜热细菌有t h e r m u st h e r m o p h i l u s p a n m z a k ie t a 1 1 9 9 8 和t h e r m u sc a l d o p h i l u s a r ke ta 1 9 9 9 1 2 3 嗜盐死海古菌 1 t a l o a r c u l a a r i s m o r t u i 产生的碱性磷酸酶 s a r a hg o l d m a n g o l d m a nse ta l 1 9 9 0 等发现在缺乏有机磷的状态下 极端嗜盐的古细菌h a l o a r c u am a r i s m o r t u i 可以产生碱性磷酸酶h a p 尼m a r i s m o r t u ia l k a l i n e 曲o s p h a t e a s e 它由一条糖蛋白多肽组成 分子 量大约是1 6 0 0 0 0 h a p 是一种诱导酶 但无机磷浓度超过0 1 m w 时 l t a l o a r c u l a m a r i s m o r t u j 便没有h a p 产生 用p i n p p 法测定得到此酶的k m 0 1 6 r n m 它的 7 浙江大学硕士学位论文 最佳p h 是8 5 和其他需要z n 的碱性磷酸酶不同 h a p 是c a 2 金属酶 当 c a 2 浓度在3 4 删时酶活力达到最高 同时它也需要较高的盐浓度以保持酶的 活性 最佳的n a c i 浓度为1 3 m 在3 4 m mc 分 和低盐浓度条件下 酶是不稳 定的 但会随着盐浓度的升高而稳定性增强 在3 2 m mc a 2 条件下 即便盐浓度 很低 酶依旧可以保持活性 但有趣的是 在高盐浓度下 酶的稳定仍然是取决 于的c a 2 浓度 1 2 4 芽孢杆菌 b a c i l l u s 产生的碱性磷酸酶 k a z u m a s at a k e d a 等发现枯草芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s 可以产生一 种与细胞膜紧密结合的a l p k a z u m a s at a k e d a a k i r at s u g i t a 1 9 6 7 k m 值大约为0 0 3 6 删 最佳p h 值为9 1 0 e d t a 可以使该酶失活 但c o 和z n 2 可以使它再次复活 地衣芽孢杆菌 显l i c h e n i f o r m i s 能产生一种胞内a l p 该酶由四个相同亚基组成 分子量为1 2 1 0 0 0 h u k d t em 1 9 8 7 而m a s a o n o m o t o 等人筛选出的b a c i l l u ss p o k 1 可以产生胞外a l p m a s a o n o m o t o 1 9 8 8 相对于其他的a l p 这种酶在较高的温度 5 0 c 6 0 c 和p h 值 p h 1 1 下达到最快酶反应速度 丁琳等人 丁琳 2 0 0 4 以枯草芽孢杆菌为菌种 液体培养制备碱性磷酸酶 研究确定了培养的最佳工艺条件 并对碱性磷酸酶的酶促反应动力学性质进行了 初步探讨 结果表明 枯草杆菌制备碱性磷酸酶的最佳工艺条件为 4 0 p h 值 7 4 振荡培养1 0h 酶活最高 对碱性磷酸酶的动力学性质研究表明 该酶催化 底物磷酸苯二钠水解反应的最适p h 值8 8 最适温度5 2 i 1 i l 值为2 9 4m o l l 1 2 5 霍乱弧菌 v i b r i oc h o l e r a e 产生的碱性磷酸酶 n i r m a lk r o y r o yn ke ta j 1 9 8 2 等在1 9 8 2 年从霍乱弧菌 v i b r i o c h o l e r a e 分离到v a p kc h o e r a e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 和其他的a l p 不同 y a p 是由单肽组成 两且分子量也较小只有6 0 0 0 0 它是c a 2 金属酶 最 佳p h 是8 0 它能水解大部分磷酸单脂键 对葡萄糖 i 磷脂可以达到最佳的水 解效果 1 2 6 索多恩微球菌 m i c r o c o c c u ss o d o n e n s i s 产生的碱性磷酸酶 r o b e r th g l e w 等人 r o b e r the ta l 1 9 7 1 发现索多恩微球菌 8 浙江大学硕士学位论文 m y c r o c o c c u ss o d o n e n s i s 可以产生一种胞外碱性磷酸酶 i i a p 它的分子 量为8 0 0 0 0 最佳p h 值为9 曲 5 正磷酸盐 亚砷酸盐 砷酸盐是它的竞争性抑 制剂 它可以水解各种磷酸单酯 双酯键 三酯键以及无机焦磷酸盐 它是c a 2 金属酶 c a 不仅可以提高酶的活性 还可以提高酶的稳定性 如果没有c a 2 m a p 更容易因温度的升高和蛋白水解作用而失去活性 它的i m 值是0 0 3 9 删 1 2 7 喜寒节杆菌 p s y c h r o p h i l i ca r t h r o 妇 t e r 产生的碱性磷酸酶 喜寒节杆菌 p s y c h r o p h i l i ca r t h r o b a c t e r 是一种典型的喜寒细菌 它一般 生长在寒带的湖泊 海洋等环境中 最佳的生长温度是5 p a l o m a 等 pd ep r a d a 占ta l 1 9 9 6 发现它可以产生胞外的碱性磷酸酶 此酶是c a 金属酶 当c a 2 浓度在5 m m 时它的酶活最好 它的最佳p h 为9 9 5 最佳反应温度在4 5 5 0 1 2 8 产酶溶杆菌 1 y s o b a c t e re n z y 日o g e n e s 产生的碱性磷酸酶 产酶溶杆菌 1 y s o b a c t e re n z y m o g e n e s 在它的生长稳定期 s t a f f o n a r yp h a s e 能产生一种胞外碱性磷酸酶 sa ue ta 上 1 9 9 1 此外它也能产生一种膜结合 的碱性磷酸酶 这两种酶的活性都会被无机磷抑制 尤其是胞外碱性磷酸酶 e p s t e i nd m w e n s i n kp c 1 9 8 8 产酶溶杆菌胞外碱性磷酸酶具有比较好的稳定性 但是当温度超过7 0 时就 会快速的失活 它们由一条多肽组成 分子量大约为2 5 0 0 0 最佳p h 是7 5 i i i l 值为0 2 2 n 幽1 磷酸盐和砷酸盐可以抑制它的活性 但e d t a 和其他的鳌合剂对它却 不起作用 与产酶溶杆菌膜结合的碱性磷酸酶以及其他的细菌碱性磷酸酶不同 它不是金属酶 它的分子量比较小 最佳p h 较低 而且它还是天然可溶酶 1 1 9 粗糙脉孢菌 n e u r o s p o r ac z a s s a 产生的碱性磷酸酶 粗糙脉孢菌碱性磷酸酶 n a p 的分子量大约为1 5 4 0 0 0 它由两个相同的 亚基组成 但与大多数的碱性磷酸酶不同 其不是金属酶 9 浙江大学硕士学位论文 表1 1 一些微生物源碱性磷酸酶的理化性质 t a b l e1 1c h a r a c t e r i s t i c so fs o em i c r o b i a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e 1 3 碱性磷酸酶的应用 1 3 1 碱性磷酸酶在环境检测中的应用 碱性磷酸酶在环境科学中也有着广泛的用途 在生物环境监测中它的酶活性 指标非常灵敏 它的酶活性的变化 客观上反映了环境污染的程度和变化 1 3 1 1 利用碱性磷酸酶生物传感器测定重金属污染 碱性磷酸酶可以水解底物m u p m e t h y l u m b e l l i f e r o y lp h o s p h a t e 产生m u f 而m u f 很容易地被荧光分光光度计测定 m u p 兰m u f f l u o r e s c e n t l p h o s p h a t e c l a u d ed u r r i e u 等人 d u r r i e uc t r a n m i n hc e t 甜 2 0 0 2 构建了碱 性磷酸酶藻类旋光传感器 在此传感器中碱性磷酸酶依附在c h l o r e l av u l g a r i s 小球藻 的膜外 这种装置只需要很微量的底物 适合由f i a 流动注射分析系 统 来测定所需的结果 碱性磷酸酶对重金属 如铬或铅 的抑制非常敏感 所以当底物中加入重金 属后 结合f i a 流动注射分析 可以非常方便经济地检测各类重金属污染 具体的流程如下图i 2 所示 1 0 浙江大学硕士学位论文 甑 f 喻 a h 黼 m u p 伽试l 霸i 神曲 m u p 拿岫i r 舢时 h e 秘 y 丌删 却 阳 图1 2a l p 结合f i a 测定重金属流程 f i g 1 2r e a c t i o ns c h e m ef o rd e t e c t i o no fm t a lb yf i ac o n b i n e di i t ha l p 这样的系统可以有效的测定各类重金属污染的程度 此外 酶法分析中也常 用到碱性磷酸酶 其检测限和灵敏度都非常好 对于监测环境中的痕量污染物具 有重要意义 碱性磷酸酶已成为环境酶学研究的重点和热点 1 3 1 2 碱性磷酸酶处理污染物 微生物降解是处理各种有机污染物的重要途径 由于碱性磷酸酶是一种非特 异性的单磷酸脂水解酶 它可以催化磷酸盐从各种有机分子脱离 所以它在一些 有机磷污染降解治理中起到非常重要的作用 特别值得一提的是 目前有机磷农 药降解酶的研究已成为世界性的研究热点之一 高明华等 高明华e f a l 1 9 9 9 发现有机磷农药的水解速率也随p h 值的增大而加快 碱性磷酸酶的嗜碱特性和 对底物的广谱性也引起了有机磷农药降解研究者的广泛关注 微生物对有机磷农药的降解一般是通过水解酶类 裂解酶和转移酶类的作用 进行 对于含有苯环的化合物还需要氧化还原酶的作用 有机磷农药的化学结构 特性 决定了磷酸水解酶类对此类化合物降解具有广谱性 由于水解酶无需辅酶 系统 对于有机磷农药初期的降解和解毒作用具有重要意义 水解酶的作用结果 是导致脱烷基 芳氧基 氨基等 因此 碱性磷酸酶不仅可用于环境监测 而且 还是环境污染物的降解酶 1 3 2 碱性磷酸酶在生物学研究中的应用 浙江大学硕士学位论文 近二十年 人们发现在酶联接免疫吸附剂测定 e l i s a 中 碱性磷酸酶有 着越来越广泛而重要的应用 因为a l p 可以作用于显色化合物或者它使底物脱磷 而发光 同时碱性磷酸酶也用于非同位素探针 斑点和测序系统 另外 碱性磷 酸酶也被用作生物传感器 m c c o m b e ta t 1 9 7 9 在分子生物学中 碱性磷 酸酶分解核酸的末端磷酸盐 是遗传工程常用的工具酶 有报道 g u oq i a n g 1 9 9 7 从一些嗜热细菌 如那不勒斯栖热袍菌 t h e r m o t o g an e a p o l i t a n a 和古热球菌 p y r o c o c c u sa b y s s y 分离得到的一 些热稳定性非常出色的碱性磷酸酶 在酶一抗体和酶一探针结合物中不容易失 活 固定在生物传感器中的碱性磷酸酶有了更长的半衰期 它可以在酶检测系统 中多次重复使用 1 4 本研究的日的和内容 碱性磷酸酶主要存在于人体 动物 植物和微生物中 目前商业碱性磷酸酶 大多产自动物体 小牛肠碱性磷酸酶 或植物体 麦芽 产率低 价格昂贵 有些热稳定性差 使它的使用受到了限制 为了得到具有自主产权的产率高 热 稳定性好的碱性磷酸酶 本研究试图从自然界和现有保藏菌种中分离 筛选产生 碱性磷酸酶的细菌 并进行菌种的分类 鉴定 以期获得产碱性磷酸酶的微生物 菌种资源 对产酶菌种进行发酵条件的优化试验 研究最佳产酶条件 为科研 医药 环保 酶产业等领域提供适用的微生物菌种资源与酶源 本研究的技术路线主要为 从土壤或保存菌种中分离 筛选产酶菌株一产碱性磷酸酶菌种鉴定 一产酶发酵条件的优化 浙江大学硕士学位论文 第二章产碱性磷酸酶菌株的分离筛选 微生物资源十分丰富 许多微生物菌种是酶的产生菌 己报道一些微生物能 产生碱性磷酸酶 为了为应用碱性磷酸酶提供高产适用的酶源 本试验以现有保 存菌种和土壤为分离源分离 筛选产碱性磷酸酶的菌株 2 1 材料和方法 2 1 1 试剂 1 0 i m o l l 碳酸盐缓冲液 p h l 0 o 称取无水碳酸钠0 6 4 9 碳酸氢钠 3 4 9 4 一氨基安替比林0 1 5 9 定溶于t 0 0 m l 蒸馏水中 2 0 0 2 m o l l 磷酸苯二钠溶液称取二水磷酸苯二纳0 5 1 9 使其定容于1 0 0 m l 沸水中 冷却后加入0 5 m l 的氯仿 置冰箱保存 3 铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0 2 5 9 硼酸1 7 9 各溶于4 0 1 水中 二液 体混合后定容至1 0 0 m l 置冰箱保存 以上试剂置冰箱保存一般不超过一周 每次都尽量现配现用 2 1 2 菌种分离 2 1 2 1 菌株来源 现有保存菌株 取自浙江大学应用微生物学研究室保存菌株 菌名及编号见 表2 1 自行分离 取自浙江大学紫金港 华家池校区土壤 取表层1 0 c m 左右以下 土壤 并剔除石砾及植被残枝等杂物 采用1 0 倍稀释法稀释三种土样 各取o i m l 1 矿 l 矿 l 矿悬液涂l b 培养基平板分离 3 0 培养 待平板上出现单菌落后 挑取形态特征不同的单菌落转接至基础培养基 葡萄糖5 9 酵母粉1 0 9 m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 n a c ii g 水1 0 0 0 n d p h 7 o 上 编号依序为h b i h b l 2 浙江大学硕士学位论文 表2 jl 用于产碱性磷酸酶菌株舞选的菌种编号 t a b l e2 1s t r a i nn u m b e ro f t h eb a c t e r i au s e df o ra l k a l i n ep h o s p h a t a s e p r o d u c i n g a 啪 菌种名称编号 k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e p a e n i b a c i l l u s f a v i a p o r u s b a c i l l u ss p a g r o b a c t e r i u ms p b a c i l l u ss p b a c i l l u ss p b a c i l l u ss p r a l s t o n i as p p s e u d o m o n a ss p b a c i l l u ss p a g r o b a c t e r i u ms p b a c i l l u s s u b t i l l sv a ra t e r r i m u s b a c i l l u s p u m i l u s b a c i l l u ss p h a e r l c u s b a c i l l u sm e g a t e r i u r a b a c i l l u sc 1 8v a rm y c o i d e s b a c i l l u sm e g a t e r i w n p h o s o p h a t i c u m b a c i l l u sc e r e u s m i e r o c o c c u ss p d i p l o c o c c u s 表中带 表示有磷脂酶活性的菌株 2 1 2 2 微孔板法初筛磷酸酶产生菌 磷酸苯二钠比色法初测碱性磷酸酶活性 将0 1 m o l l 碳酸盐缓冲液 含4 一 氨基安替比林 p h l o o 5 0 h1 点样于4 0 孔微孔板中 对照孔加量为5 5 l l1 用灭菌牙签取各菌种等量菌苔与缓冲液充分混匀 于3 7 c 水浴5 m i n 再加入已 预热的磷酸苯二钠溶液 o 0 2 m o l l 5 0pl 3 7 c 反应1 5 m i n 加入铁氰化钾溶 液1 5 0i l1 显色并终止反应 重复二次 板 以红色深浅初筛磷酸酶产生菌 微孔板点样如表2 2 所示 1 4 博勰鲜错诽挪诽 m哪 m酤阱 金耵髓附眺嘶 浙江大学硕士学位论文 表2 2 徽孔板点样圈 t a b l e2 2s k e t c ho fs i c r o p l a t e 2 1 2 3 产酶菌株碱性磷酸酶活力测定 取目的菌种两环接于l o m ll b 培养液中摇床培养过夜 取菌悬液i m l 接种 于2 0 m ll b 培养液中 3 0 c 1 5 0 r m i n 摇床培养 于2 4 h 4 8 h 分别各取5 m l 发 酵液高速冷冻离心 6 5 0 0 0 r p m l o m i n 收集上清液 细胞外酶 备用 细胞沉淀用生理盐水洗涤一次 离心6 c 5 0 0 0 r p m 1 0 m i n 弃上清 取细 胞加5 m l0 l m o l l 碳酸盐缓冲液制成细胞悬液 冰水浴超声波粉碎细胞 1 2 0 w 处理3 s 间隔6 s 处理1 0 0 次 离心6 5 0 0 0 r p m l o m i n 收集上清液 细胞 内酶 备用 磷酸苯二钠比色法测试碱性磷酸酶活性 分别取细胞外和细胞内上清酶液0 5 m l 加入到1 o m l 含有0 1 5 4 氨基安替比林的碳酸盐缓冲液 0 1 m p h l o 3 7 水浴5 m i n 再加入0 0 2 m 磷酸苯二钠1 o m l3 74 c 水浴1 5 m i n 后立即加入3 m l 铁氰化钾溶液显色立即充分混匀 用北京瑞利分析仪器公司产的u v 9 1 0 0 分光 光度计于5 1 0 n m 波长处比色 用蒸馏水调零 以未接种的培养液为对照 酶活定义为 3 7 c 下每分钟产生l p m o l 游离酚的酶量为一个酶活单位c o 2 1 2 4h b l 菌株的产酶时间 接菌株h b l 于基础培养液 每隔一定时间取样测酶活 并同时测细胞生长量 由于h b l 发酵液非匀质 故取5 m l 发酵液高速冷冻离心 条件同上 并以生理 盐水洗涤一次 加生理盐水5 m l 制成细胞悬液 以生理盐水为对照于6 0 0 r a n 测 0 d 值作为细胞生长量 2 1 2 5 不同p h 缓冲溶液对酶活的影响 为确定最佳的缓冲液p h 选择在不同p h 7 8 9 1 0 1 1 值的缓冲溶液 中用磷酸苯二钠比色法测试碱性磷酸酶活性 2 1 2 6 酶的热稳定性试验 溉江大学硕士学位论文 用不同的温度 2 0 c 3 0 c 3 5 4 0 c 4 5 c 5 0 c 预处理上清液3 0 m i n 然后用磷酸苯二钠比色法于3 7 测试碱性磷酸酶活性 2 1 3 主要仪器 冷冻离心机 恒温培养箱 电热恒温水浴锅 s c 1 5 型数控超级恒温槽 宁 波海曙天恒仪器厂 p h s 3 c 型精密p h 计 上海精科雷磁 u v 9 1 0 0 型分光 光度计c l l 京瑞利分析仪器公司 j y 9 2 i i 型超声波细胞粉碎机 宁波新芝科器 研究所 2 2 结果与分析 2 2 1 碱性磷酸酶产生菌的微孔板初筛 将自行分离的1 2 株菌和已有的保存菌株2 0 株共3 0 株菌株用微孔板法初筛 磷酸酶产生菌 试验结果见图2 1 图2 1 徽孔板法初筛磷酸酶产生菌 f i g2 1i s o l a t i o nt h es t r a i nc a l lp r o d u c ea l pi nm i c r o p l a t e 根据显色深浅可初步判断各