（光学工程专业论文）pmma基pcr生物芯片的准分子激光微加工、键合、封装技术研究.pdf

摘垫 摘要 本文主要从微流控芯片微通道的微加工 密封微流路的键合技术和整体 p c r 微流控芯片系统封装这三个方面对微流控芯片进行了深入的研究 本文探讨了2 4 8 n m 的准分子激光对于高聚物材料的加工机理 总结和分 析了现有的理论模型 研究了各种实验加工参数对于刻蚀p m m a 材料的影响 并在此基础上得到了适合p m m a 基p c r 微流控芯片微通道加工的工艺参数 能 够实现通过改变工艺参数和加工步骤控制微通道的尺寸和表面形貌 同时首 次提出了利用低能量准分子激光对微结构进行非接触 无应力的新型抛光方 法 显著提高了微结构的表面质量 本文针对微流控芯片内部微通道尺寸微小 分布复杂的特点 主要研究 了胶粘键合技术和热键合技术 在掌握键合机理的基础上设计了键合装置 改进了键合方法并总结了各种键合参数对于微流控芯片总体键合效果的影 响 得出了适用于微流控芯片键合的稳定可靠的键合方法和工艺参数 本文根据p c r 反应条件的要求 集成封装了p c r 微流控芯片上的微流 路单元 温控单元和接口单元 不仅能够实现反应单元与进样系统的准确连 接而且可以保证芯片内部各反应温区彼此独立且同一温区内部分布均匀 整 体上采用了双列直插d i p 的封装形式 通过与外置控制部分的联用 简化了 p c r 反应装置 为整个p c r 微流控芯片系统的制作打下了基础 关键词微流控芯片 准分子激光 p m m a 键合 封装 一 一 主三些查兰三兰璧圭兰簦丝兰 a b s t r a c t t h i sw o r kd e s c r i b e st h ed e v e l o p m e n to fm i c m f l u i d i c b i o c h i p si nt h ef i e l do fm i c m c h a n n e l f a b r i c a t i o n b o n c l i n g o f m a t e r i a l sa n d p a c k a g i n g o f w h o l e b i o c h i ps y s t e m t h em e c h a n i s mf o rt h ee t c h i n go f p o l y m e r sb yu l t r a v i o l e tl a s e r si sd i s c u s s e d a c c o r d i n gt o t h e e x p e r i m e n td a t a o fp m m au n d e rt h er a d i a t i o no f2 4 8 n mk r fe x c i l t l e r l a s e r t h e r e t a t i o n s l a i p b e t w e e ne t c hr a q fp i 镭 aa n 4e a t m e tl a s e rm 4 a g o ni s a a z 2 y z e d t h e c o u p l i n g e f f e c to f m u l t i p l e w o r k i n gp a r a m e t e r so n t h es i z ea n d a p p e a r a n c eo f m i c r o c h a n n e l i s d i s c u s s e da n dg t u r n n a r i z e d a n e p o l i s h m e t h o df o rm i c r o s t r u c t u r e si sp r o v i d e db a s e do nt h e m e h a n s m o f o w g u e n c ec d t m e i a s c r t h b t i c a t i o n t t u s p o l i s k 讯譬硪o d e i 西噎w 靶s t h e s 纽 e s s w h i c hm a y d a n l a g e t h em i c r o s t m c t u r e b ya v o i d i n gt h ec o n t a c to f m i c r o s t m c t u r ea n d p o l i s h e d e v i c e s t h ep r o t e c t i o no ft h ec o m p l i c a t e dm i c r o c h a n n e l ss h o u l db et a k e ni n t oc o n s i d e ri nt h e b o n d i n go fm i c r o f l u i d i cb i o e h i p s t h et h e o r yo fa d h e g i v eb o n d i n ga n dd i r e c tw a f e r b o n d i n gi sp r e s e n t e d as y s t e mo fb o n d i m gi jd e s i g n e da n dt h em e t h o dq f 打o n d i r t gi s i m p r o v e d t h r o u g h al o to f b o n d i n ge x p e r i m e n t s t h er e l i a b l eb o n d i n gp a r a m e t e r sa r e s e t l l ed o w nw l h m i tl o s so fm i c r o c h a n n e lq u a l i t y d e s i g na n di n t e g r a t et h em i c r o f l u i d i c s c o n n e c t i o n sa n dt e m p e r a t u r ec o n t r o l l e r so f p c rr e a c t i o n 1al i t t l eb i d c h i pt a k i n gt h e 佑r mo fd i p p a e k a g i n gi nm i c r o e l e c t r o n i c t h i sb i o c h i pp r o v e st h er i g h t 硼n n e c t i e nb e t w e e nm i c r 0 6 u i d i c sa n do u t s i 4 ec o n t r o l o r i ta l s op r o v i d e dt h r e ei n d i v i d u a l l yh o m o g e n e o u sh e a t i n ga r e a w h i c hi se s s e n c i a lf o r t h er e a l i z a t i o n 汀w h o l es y a e mo fp c r c h l p k e y w o r d sm l c r o f l u i d i cb i o e h i p e x c i m e rl a s e r p m m a b o n d i n g p a c k a g i n g i l 北京工业大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 签名 茎睑日期 关于论文使用授权的说明 w 妒护易 本人完全了解北京工业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权 保留送交论文的复印件 允许论文被查阅和借阅 学校可以公布论文的全部或部 分内容 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存论文 保密的论文在解密后应遵守此规定 虢趣蝓聊虢驰i 隰坦业 第一章绪论 1 1 本课题的研究背景 第一章绪论 生物芯片技术是9 0 年代初期以来发展的一项新兴技术 它是分子生物学和 微电子 徽加工 微机械等学科的交叉产物 生物芯片的实质就是缩小了的生物 化学分析器 通过微加工技术制成的生物芯片 将微米结构与生物化学处理结合 把成千上万乃至几十万个生命信息集成到一个很小的氧化硅 玻璃或塑料等材质 制成的j g 片上 由于最初的生物 吝片主要日标是用于d 序列的测定 基因表达 谱鉴定和基因突变体的检测和分析 因此又被称为d n a 芯片或基因芯片 目前这 项技术已经扩展至疾病硷断 新药开发 生命科学研究等诸多领域 现已成为各 国学术界和工业界所瞩目的研究热点 j f 1 1 1 第一代生物芯片技术 第一代生物芯片主要是指基因芯片 这种生物芯片的制备主要依赖于精细 加工 自动化及化学合成技术 根据不同的技术使用要求 采用微加工技术在基 底材料上加工出各种微细结构 然压再施加必要的生物化学物质并进行表面处 理 这类生物芯片的主要制作法有 点接触法 光刻d n a 合成法 喷墨法和原 位合成法等 点接触法是在生物苍片制釜过程中 通过精密机械手 精确移动 让移液头 与芯片接触而将d n a 探针涂敷在芯片上 这种方法的优点是快速 经济 功能 多 缺点是每个样品都必须是合成好的 经过纯化的 事先保存的 喷墨法是将合成好的寡核瞢酸撩针通过压电晶体或其他摧进彤式定点喷射到 芯片上并加以固定来制作芯片 它需要的样品同点接触法一样 需要合成好的纯 样品 区别是喷嘴与 苎 片不接触 光刻d n a 合成法是把微加工技术豹光刻工艺与毙化学合成法褶结合的产物 合成的密度和精度优于前两种方法 但缺点是需要花费大量的时间去设计和制作 价格很高的照相掩模版 通过以上凡种方法在微型芯片上合成了高密度彦勺寡核苷酸探针阵列 将探针 阵列与待分析的d n a 序列同步杂交 用高分辨率的检测装置进行扫描检测 再 结合计算机系统分析处理 可以快速获取所需的遗传信息 1 1 2 第二代生物芯片技术 生物分析仪器及过程的微型化和集成化已成为生命科学 化学等领域研究和 开发的重要方向之一 生物芯片研究人员的最终研究目标是对分析的全过程实现 全集成 即微缩j 芷 片实验室 这其中的主要组成部分是微流控分析芯片 它通过 分析化学 微电子学 生物医学等领域的交叉 使复杂生物化学样品从试样处理 分离到检测的分析全过程在微流控芯片上完成 由于结构尺寸的缩小 微流控芯 片可在数秒至数十秒内自动完成测定 分离或其它更加复杂的操作 分析和分离 的速度常高于相对应的宏观分析方法一至二个数量级 这是由于微米级通道中的 高导热和传质速率 与通道直径平方成反比 从而极大地减少样品试剂的消耗 提高分析速度 实现生物化学分析系统以高通量检测 高分辨分离和多维为特点 的整体微型化 自动化 表 1 1 为两代生物芯片的对比 表 1 1 微流控芯片与基因芯片 t a b l e 1 1 m i c r o f l u i d i c d n ab i o c h i p 微流控芯片基因芯片 主要依托学科分析化学 m e m s生物学 m e m s 结构特征微流路微阵列 工作原理微通道内的流体控制 生物杂交为主 应用领域 全部分折领域d n a 等专j i j 生物领域 集成化对象全部化学分析功能高密度杂交反应阵列 1 2 微流控芯片的发展 微全分析系统 1 的概念是1 9 9 0 年首次由瑞士c i b a g e i g y 公司的m a n z 与 w i d m e r 提出 当时主要强调了分析系统的 微 与 全 及微通道网络的m e m s 加 工方法 而并未明确其外型特征 次年m a n z 等即在平板微芯片上实现了毛细管 电泳与流动注射分析 从而把微系统的主要构型定位为一般厚度不超过5 m m 面 第一帝绪论 积为数平方厘米至十几平方厘米的平板芯片 1 9 9 4 年始 美国橡树岭国家实验室 r a m s e y 等在m a n z 的工作基础上发表了一系列论文 改进了芯片毛细管电泳的进 样方法 提高了其性能与实用性 引起了更广泛的关注 在此形势下 该年首届 t a s 会议以工作室的形式在荷兰e n c h e d e 举行 起到了推广微全分析系统的作 用 1 9 9 5 年美国加州大学b e r k e l e y 分校的m a t h i e s 等人在微流控芯片上实现 了高速d n a 测序 微流控芯片的商业开发价值开始显现 而此时微阵列型的生物 芯片已进入实质性的商品开发阶段 同年9 月 首家微流控芯片企业c a l i p e r t e c h n o l o g i e s 公司在美成立 虽然只有3 0 多名雇员 但一年即集资近千万美元 1 9 9 6 年m a t h i e s 等又将基因分析中有重要意义的聚合酶链反应 p c r 扩增与 毛细管电泳集成在一起 展示了微全分析系统在试样处理方面的潜力 次年他们 又实现了微流控芯片上的多通道毛细管电泳d n a 测序 从而为微流控芯片在基因 分析中的实际应用提供了重要基础 与此同时 有关企业中的微流控芯片研究开 发工作也在加紧进行 1 9 9 8 年之后专利之战日益激烈 一些微流控芯片开发企业 纷纷与世界著名分析仪器生产厂家 其中包括惠普 p e 岛津 日立等 合作 利用各自的优势技术平台抢先推出首台微流控分析仪器 1 9 9 9 年9 月惠普与 c a l i p e r 联合研制的首台微流控 芯片商品化仪器开始在欧美市场销售 至2 0 0 0 年8 月己可提供用于核酸及蛋白质分析的5 6 种芯片 其他几家厂商也于2 0 0 0 年开始将其产品推向市场 b u r n sm a 等也建立了 个集成分析系统 当把d n a 和试剂溶液等加入装置中 相应基因信息的电子信号就能够给出 这个装置包含 有一个纳升级的液体进样器 一个样品混合器和一个定位系统 个可控温的反 应室 一个电泳分离系统和一个荧光检测器 整个系统中除了激发光源 压力源 和控制电路部分 其他部分都通过光刻印刷术制作在由一片玻璃及硅片组成的芯 片结构上 可见生物芯片的发展依赖于微加工技术的迸步 目前生物芯片的微加工工艺 还处于发展阶段 不但造价高 而且过程复杂 同时芯片基材对生物反应的兼容 性差 这些影响已经成为制约生物芯片发展和走向市场应用的重要因素 1 3 常用微流控芯片制作技术 针对目前被广泛采用的硅 玻璃等基材的微流控芯片的制作技术 主要来 源与微电子工艺 包括以下几种方法 3 北康t 业人学t 学坝i 学位论义 1 光刻工艺 光刻是用光刻胶 掩模和紫外光进行微制造 工艺如下 a 仔细地将基片洗 净 b 在干净的基片表面镀上一层阻挡层 例如铬 二氧化硅 氮化硅等 c 再 用甩胶机在阻挡层上均匀地甩上一层几百a 厚的光敏材料 光刻胶 光刻胶的实 际厚度与它的粘度有关 并与甩胶机的旋转速度的平方根成反l t d 在光掩模上 制备所需的通道图案 将光掩模复盖在基片上 用紫外光照射涂有光刻胶的基片 光刻胶发生光化学反应 e 用光刻胶配套显影液通过显影的化学方法除去经曝 光的光刻胶 这样 可用制版的方法将底片上的二维几何图形精确地复制到光刻 胶层上 烘干后 利用未曝光的光刻胶的保护作用 采用化学腐蚀的方法在阻挡 层上精确腐蚀出底片上平面二维图形 用光刻的方法加工微流控芯片时 必须首先制造光刻掩模 对掩模有如下要 求 j 掩模的图形区和非图形区对光线的吸收或透射的反差要尽量大 2 掩模的 缺陷如针孔 断条 桥连 脏点和线条的凹凸等要尽量少 3 掩模的图形精度要 高 通常用于大规模集成电路的光刻掩模材料有涂有光胶的镀铬玻璃板或石英 板 用计算机制图系统将掩模图形转化为数据文件 再通过专用接口电路控制图 形发生器中的爆光光源 可变光阑 工作台和镜头 在掩模材料上刻出所需的图 形 但由于设备昂贵 国内一般科研单位需通过外协解决 延迟了研究周期 由于 微流控芯片的分辨率远低于大规模集成电路的要求 近来有报道使用简单的方 法和设备制各掩模 用微机通过c a d 软件将设计微通道的结构图转化为图象文 件后 用高分辨率的打印机将图象扣 印到透明薄膜上 此透明薄膜可作为光刻用的 掩模 基本能满足微流控分析芯片对掩模的要求 2 湿法刻蚀 w e te t c h i n g 在光刻过的基片上可通过湿刻和干刻等方法将阻挡层上的平面二维图形加 工成具有一定深度的立体结构 近年来 使用湿法刻蚀微细加工的报道较多 适用 于硅 玻璃和石英等可被化学试剂腐蚀的基片 已广泛地用于电泳和色谱分离 湿法刻蚀的程序为 a 利用阻挡层的保护作用 使用适当的蚀刻剂在基片上刻蚀 所需的通道 b 刻蚀结束后 除去光胶和阻挡层 即可在基片上得到所需构型的 微通道 c 在基片的适当位置 一般为微通道的端头处 打孑l 作为试剂 试样及 辣一年绪论 缓冲液蓄池 刻有微通道的基片和相同材质的盖片清洗后 在适当的条件下键合 在一起就得到微流控分析芯片 玻璃和石英湿法刻蚀时 只有含氢氟酸的蚀刻剂 可用 如h f 酬0 3 h f n h 4 f 由于刻蚀发生在暴露的玻璃表面上 因此 通道刻 的越深 通道二壁的不平行度越大 导致通道上宽下窄 例如 1 0 um 深的通道 上宽 为4 8u1 1 3 下宽为3 2um 这一现象限制了用湿法在玻璃上刻蚀高深宽比的通道 3 等离子体刻蚀o p l a s m ae t c h i n 曲 等离子体刻蚀是一种以化学反应为主的干法刻蚀工艺 刻蚀气体分子在高频 电场作用下产生等离子体 等离子体中的游离基化学性质十分活泼 利用它和被 刻蚀材料之间的化学反应 达到刻蚀微流控芯片的目的 等离子体刻蚀吕应用于 玻璃 石英和硅材料上加工微流控芯片 如石英毛细管电泳和色谱微芯片 先在 石英基片上涂上一层正光胶 爆光后脱落的光胶 低温烘干后 放置好掩模 用紫 外光照射后显影 在光胶上会产生微结构的圉象 然后用活性c h f 等离子体刻 蚀石英基片 基片上无光胶处会产生一定的深度通道或微结构 这样可产生高深 宽比的微结构 近来 也有将等离子体刻蚀用于加工聚合物上的微通道的报道 1 4 激光微加工技术 j 4 1 激光微加工技求摄述 在生物芯片的制备中广泛的使用到了微加工技术 利用微加工技术 能在芯 片上制作出极为精细和复杂的通道几何结构既微流路系统 使得在几平方厘米的 小面积上仍然可以完成一些复杂的操作和功能 激光微加工技术主要包括激光直 接写入 激光蚀刻等 随着激光微加工技术本身的发展 它也会被更广泛的应用 到生物 卷片的制作中 1 4 2 激光刻蚀技术 激光亥 蚀技术是将激光束 聚焦或菲聚焦j 以 定的方式辐照至材料表面 利用激光和材料相互作用的直接断键汽化的机理 烧蚀 a b l a t i o n 对作用区 域的材料进行逐层剥蚀的加工 这种刻蚀不需要任何液相腐蚀剂 实际上是一种 光物理作用 该技术能很好地用于生物医学仪器的核心元器件的加工带 作中 如 北京工业人学t 学硕二卜学位论文 生物分析仪和生物传感器等的大规模精确过孔序列及喷口制作 就可适时地采用 激光刻蚀技术 1 另外 激光刻蚀技术可应用更复杂结构的制作中 为大量制造 微流路系统提供了可能性 这样就为下一代生物芯片 微流控类分析芯片的制 备提供了新的制备方式 已经有一系列的实验证明 通过激光刻蚀技术制作的一 些复杂微流路结构 如储液池 互联通道等时 能够同时获得很快的加工速度和 良好的统一性 而且加工面积可以不受光束尺寸的限制 因此这些特点可以使其 在同一基底上制做出复杂的结构 激光刻蚀技术需要掩模来确定刻蚀的图案 因 此掩模的制作非常重要 制作掩模的材质 在激光的工作波长范围内必须是透明 的 根据微流路结构的需要 掩模被有选择的覆盖并帝 成一定的图案 对于加工 材料的选择电是激光刻蚀过程中的一项重要内容 一般选择闽值低易被刻蚀的材 刳 在加 过程中激光光束通过匀束器后照射到掩模上 在通过透镜系统后 这 样可使加工范围不局限于光束的尺寸 照射至 所要加工的材料上 用来获得所需 的结构 1 4 3 激光直接写入技术 激光直接写入是一项新发展起来的激光加工工艺 它将激光技术 c a d c a m 技术 材料科学及微细加工技术有机的结合起来 既可以在光刻胶上直接刻出三 维结构也可以用于加工掩模 激光直接写入系统性能稳定 造价便宜 结构简单 使用方便等特点 使其受到广泛关注 并在微流路的加工中得到应用 近年来 激光直接写入技术的发展使得激光微加工技术成为微制造 预成型 快速模型设 计等领域中有用而灵活的工具 并已被用于制造三维微结构 这是传统工艺所不 能实现的 此外这项技术还可用于微结构加工中的后期处理等方面 在加工过程中激光直接照射到硅等所要加工的材料上 通过微机控制工作台 和光刻头在一定的平面上的移动和扫描来制成所需的结构 1 通过这种加工方式 所获得的微型通道具有整齐的边缘 而且所获得的通道宽度与设计的宽度一致性 好 通道的宽度由材料所吸收的激光能量决定 深度则由保护气体的压力和扫描 的速度共同决定 在用这项技术加工三维结构时 首先将三维图形分解为同等厚 度的许多层 通过最优化设计 使得加工每一层的轮廓时工作台的移动最小 这 种三维微加工技术对于微流路的制作有着重要意义 而且在微流路的设计过程 第一章绪论 中 这项技术的快速成型及灵活的特点 对于复杂的设计过程有着很大的帮助 不过一些较大规模的结构仍需要激光掩模投影刻蚀来进行 此外 还可以通过多 光束同时写入来提高这 系统的效率和性能 1 4 4 激光微成型技术 以上两种加工技术都是通过去除材料得到微型结构的手段 除此之外 激光 金属沉积技术可以通过激光辐照将气相 液相或固相先驱物 金属有机化合物 中的金属还原为零价元素 使其沉积到基体材料表面从而形成特定的图形 另外 还可用激光烧结法制造多种材料的三维微结构 选择性激光烧结余属粉末制作微 型部件的原理是 通过在基体上铺一薄层金属粉 用聚焦激光束按照零件的分层 轮廓对金属粉末进行有选择的烧结 一层一层全部烧结完后 去掉松装粉末即得 到所需的微结构 这些技术克服了目前所采用的技术中存在的加工材料单一 成本高 制造复杂三维微结构困难等弱点 1 5 本文研究内容 本文的课题来源是国家自然科学基金项目 采用准分子激光的生物芯片微加 工技术研究 和北京市自然科学基金项目 高聚物基p c r 生物芯片的准分子激 光制备方法及应用研究 本文研究内容主要包括以下几方面 1 高聚物基微流控芯片的准分子激光微加工机理及工艺的研究 本文根据现 有的紫外光刻蚀高聚物的理论模型和2 4 8 n m k r f 准分子激光刻蚀p m m a 材料的实验数据 分析了准分子激光对于高聚物材料的刻蚀机理 并在此 基础上总结出了适用于微流控芯片上微通道加工的工艺参数 提出了利用 低能量准分子激光对微结构迸行非接触 无应力的新型抛光方法 显著提 高了微结构的表面质量 并加工出了多种p c r 微流控芯片所用的循环微 通道结构和其他种类的微流控芯片 2 微流控芯片键合技术 加工后的微通道结构只有经过与盖片的键合形成封 闭的微流路后才能用于微流控芯片中 本文针对微流控芯片内部微通道尺 寸微小 分布复杂的特点 研究了胶粘键合技术和热键合技术 改进了键 合方法并总结了各种键台参数对于微流控芯片总体键合效果的影响 得出 北京丁业人学工学坝j 一学位论文 了适用于微流控芯片键合的稳定可靠的键合方法和工艺参数 3 p c r 微流控芯片整体的设计和封装 本文根据p c r 反应条件的要求 分 别制作并集成了p c r 微流控芯片上的微流路单元 温控单元和接口单元 采用t x x f j 直插d i p 形式的封装 通过与外置控制部分的连用 简化了 p c r 反应装置 为整个p c r 微流控芯片系统的制作打下了基础 笫一章p c r 生物芯j f 的构成 第二章p c r 生物芯片的构成 2 1 p c r 技术简介 p c r p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 体外核酸扩增技术 具有 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等优势 最初的体外核酸扩增 技术设想由k o r a n a 于1 9 7 1 年提出 1 9 8 5 年美国p e c e t u s 公司人类遗传研究室 的m u l l i s 等将这些设想变为现实 发明了聚合酶链式反应 之后 经过k e o h a n o g s a i k i 等人的改进后 p c r 技术得到了广泛的应用 并给生物学和医学带来了一 场革命 1 9 9 3 年m i c h a e ls m i t h 和k a r ym u l l i s 凭借该项技术荣获了的诺贝尔化 学奖 p c r 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一d n a 片段于数小时内 扩增至十万乃至百万倍 使肉眼能直接观察和判断 可从一根毛发 一滴血 甚 至一个细胞中扩增出足量的d n a 供分析研究和检测鉴定 过去几天几星期才能 做到的事情 用p c r 几小时便可完成 p c r 技术是生物医学领域中的一项革命 性创举和里程碑 目前 被广泛的应用于科研 临床诊断 免疫学和动 植物学 等多个领域 p c r 扩增技术的基本原理类似于d n a 的天然复制过程 其特异性依赖于与 靶序列两端互补的寡核苷酸引物 p c r 过程有以下三个基本步骤组成 如图2 一l 1 模板d n a 的变性 模板d n a 被加热至高温9 5 c 左右经过一定时间后 模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 分解成为两个单链 以便与引 物结合 2 模板d n a 与引物的退火 温度降至5 0 c 左右时 引物与模板d n a 单链 的互补序列配对结合 3 引物的延伸 升温至7 2 左右 模板d n a 与引物的结合物在t a q d n a 聚 合酶的作用下 以d n t p 为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制 原理 合成一条新的与模板d n a 链互补的半保留复制链 新的半保留复制链 再重复经过变性一退火 延伸三个过程 就可以复制出更多的半保留复制链 p c r 的三个反应步骤重复进行 即可实现d n a 扩增量的指数倍上升 其扩增 9 童三些查兰三兰竺 j 芏竺笙兰 量可由公式y 1 石 得到 其中y 表示d n a 片段扩增后的拷贝数 x 表示 平均每次的扩增效率 n 表示循环次数 图 2 1 p c r 扩增过程 f i g 2 1 p c rr e a c t i o n 影响p c r 反应的条件包括 温度 时间和循环次数 1 变性温度与时i s j 变性温度低 就无法形成单链d n a 模板 这是导致p c r 失败的最主要原因 一般来说9 3 一9 4 时l m i n 即可使模板d n a 变性 若低于 9 3 则需要延长时间 但是过高的温度会对酶的活性有影响 通常该温度设定在 9 0 一9 5 之例 2 退火温度与时蒯 变性后温度快速冷却至4 0 c 6 04 c 后 可使引物和模板 发生结合 由于模板d n a 比引物复杂得多 引物和模板之间的碰撞结合机会远 远高于模板互孙链之间的碰撞 退火温度与时间 取决于引物的长度 碱基组成 及其浓度 还有靶基序列的长度 对于2 0 个核苷酸 g c 含量约5 0 的引物 5 5 c 作为退火温度的起点较为理想 引物的退火温度可通过以下公式计算 解链温度值 t m 4 g c 2 a t 第二帝p c r 生物芯片的构成 退火温度值 t a t m 一5 在t m 允许范围内 选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异性 结合 提高p c r 反应的特异性 退火时间一般为3 0 一6 0 s e c 足以使引物与模板之 间完全结合 3 引物延伸温度 与u i n 该温度取决于t a q d n a 聚合酶的最适温度 一般取 7 0 7 59 c 在7 2 4 c f l j 酶催化核苷酸的标准速率可达3 5 1 0 0 个核苷酸 秒 每分钟 可延伸l k b 的长度 其速度取决于缓冲溶液的组成 p h 值 盐浓度与d n a 模板 的性质 过高的延伸温度不利于引物与模板的结合 p c r 延伸反应的时间 可 根据待扩增片段的长度而定 一般1 k b 以内的d n a 片段 延伸时间l m i n 即可 3 4 k b 的靶序列需3 4 r a i n 扩增1 0 k b 需延伸至1 5 r a i n 延伸时间过长会导致非特 异性扩增带的出现 4 循环次数 循环次数决定p c r 扩增程度 次数少则产量低 但次数越多 非特异性产物的量也随之增多 因此在p c r 扩增设备的制作中 对于温度的控制至关重要 p c r 热循环仪是 目前被广泛使用的p c r 扩增仪 其工作方式为 在微机控制的温度循环其中置入 扩增混合物的反应容器 加入模板或试样d n a 进行2 0 3 0 次温度循环 即可 完成扩增过程 从控温方式来分有四种 压缩机制冷式 p e l t i e r 半导体制冷 电 加热风扇冷却 水浴锅加热 其特点如表 2 1 所示 表 2 1 p c r 扩增仪 t a b l e 2 1 p c r s y s t e m 控温方式特点 压暂舀制冷式 采用电阻丝加热具各低温功能 存在升降温度的过冲问题 温度较难直接测量 升降温速度慢 一般要j 2 秒i 度 i 札i 1 随时间的延陡 升降 温速度变错更慢 易受电压的变化而影响升降温的速度 p e t t i e r 半导体制冷 升降温速度快 可以达2 3 度 秒 可以有很低的温度 控温简 单并较糟确 缺点是寿命短 p e l t i e r 元件易损 水浴加热器温度控制叫以直接用温度计测量 温度均匀 次反应容量大 戍用时1 i 存舟升降温度 不能进行复杂的p c r 操作 电加热风扇冷却没有低温功能 温度的均匀性也有问题 j 兰二 业查兰三兰 茎兰兰些笙兰 常规p c r 扩增仪 存在着热容大 加热速度和冷却速度慢 样品耗用高等 缺点 通常完成一个扩增循环通常需要几到十几分钟 因此对于3 0 个循环的扩 增过程需要花费数个小时 而且对于反应物的需求量大 于是随着p c r 技术的 广泛应用以及m e m s 技术 微流控芯片技术的发展 p c r 微流控芯片的研制得 到了越来越多的关注和发展 p c r 微流控芯片具有很多优点例如能降低热容量 缩短扩增和分析时间 提高分析速度 对于样品的消耗量小 以及低廉的造价和 可抛弃性 2 2 p g r 微流控芯片系统 2 2 1 p c f t 微流控芯片的发展 微型化的芯片p c r 不仅节约空间和试剂 其优点还表现在 1 加热和冷却系统体积小 热容量小 可达到较高的 1 5 4 0a 2 s 的加热 和冷却速率 而常规p c r 热循环仪的速率仅为2 一 0 c s 2 由于尺寸的缩小使得比表面积增大 增加了热传导效率 大大缩短了p c r 反应时间 3 易于集成化 不仅可以通过薄模沉积和微加工技术在芯片底部将控温单元 的各部件集成为薄膜电阻 紧贴于液体样品 进行热传递 还可将p c r 扩增系统与其他操作系统集于一体 实现整个实验室的微型化 自动化 提高分析速度 我们通过表 2 2 对p c r 扩增仪与p c r 微流控芯片进行了多方面比较 表 2 2 p c r 扩增仪与p c r 微流控芯片对比 t a b t e 2 2 p c rs y s t e mv sp c rb i o c h i p p c r 扩增仪p c r 微流控芯片 检测对象基因基因 检测品种单一检测同时多项检测 结果分析电泳分析不能确定其特定序列由光纤光谱仪和微机分析能确定其特定 效果有一定假阳性和漏检率准确 灵敏 可靠 检测对阅约3 4 小时约十几分钟 第二章p c r 生物芯片的构成 成本 高 4 0 2 0 0 万元 低 1 0 万 消耗试剂需扩增至5 0 l o o n g 数量级 需扩增至p g 数量级 近年来 p c r 微流控芯片受到了愈加广泛的关注 并取得 些研究成果 1 2 2 0 第一个p c r 微流控芯片由n o r t h r u p 在1 9 9 3 年提出 他利用在硅上刻蚀微槽并 与p y r e x 玻璃片键合形成了包含一个入1 3 和出口的微反应室 这一芯片对于反应 物的需求量仍然相对较大在2 5 5 0 p l 但热循环速率已经提高了2 1 0 倍 之后 在9 0 年代末d a n i e l 等人丌发出了以硅为基材仅需l l 反应物的快速 3 0 循环仅 用2 5 r a i n p c r 微流控芯片 但是这一产品的缺点是无法对p c r 产物进行光学 检测 m e m s 技术的发展极大的推动了p c r 微流控芯片微室尺寸的进一步缩小 和热循环时间的缩短 p o s e r n a g a i m a t h i e s 等人也分别在p c r 微流控芯片研制领 域取得了不同的进展 但在这种p c r 微流控芯片上 样品和试剂液一直处于静止 状态 只依靠单一温控加热源通过多次温度 时间循环 来控制p c r 反应 1 9 9 8 年 m a n z k o e h l e r 等人又将毛细管结构应用到了以硅为基质的芯片上 首次制作 了具有动态流动特征的p c r 微流控芯片 即连续流动型p c r 微流控芯片 以此来 取代静态微反应室 这种结构实现了p c r 系统中由时间向空间的转换 既维持系 统不同地方的温度恒定 而是样品流经不同的温区 这种方式能够大大提高反应 速度 实现快速p e r 反应 此外也扩大了样品容量的选择范围 是微流控芯片技 术发展的一次巨大革命 2 2 2p c r 微流控芯片系统的构成 p c r 微流控芯片系统的总体结构主要由进样单元 p c r 反应单元 温控单元 和检测单元组成 如图2 2 所示 北京工业 学t 学顺卜学位论文 图2 2p c r 微流控芯片结构图 f i 9 2 2l a b o n a c h f pf o rp c r 1 p c r 反应物 参加p c r 反应的物质主要有五种r 口引物 酶 d n t p 模板 和m g 这是p c r 反应五要素 2 进样单元用于控制反应物的引入和混合 以及微流体的驱动和控制 通过 对通道内流体的操控 完成芯片系统地分析功能 微流控芯片系统中操作 的核心是对微流体的控制 通过对微通道网络内流体的控制 完成分析过 程所需的各种操作 微流控技术可分为 驱动 微泵 控制 微阀控制 芯片微通道构型控制 通道表面性质控制 3 p c r 反应单元是指进行p c r 反应的微室或微通道 按其结构可分为微室 静态p c r 和连续流动p c r 1 1微室静态温度循环p c r 微流控芯片 m i c r oc h a m b e rs t a t i o n a r y t h e r m o c y c l i n gp c rc h i p 的反应单元通常是在硅或玻璃上加工出p l 一此级 的微室结构或是阵列微室 实验证明 微室体积大于8 5 p l 就可成功的进 行p c r 扩增 2 连续流式p c r 微流控芯片反应单元中 不同区域的温度固定不变 试样循环流过不同温区实现扩增 p c r 反应物在某一温区的滞留时间决定 于该区域通道的长度 通道截面以及反应物的流速 通过优化这些参数可 得到最大的扩增效率 与静态p c r 相比 连续流式流过不同温区时自动 变温 速率 l o o m s 比表面积大 反应时间短其基本构型可分为 逶迤形 和螺旋形 4 温度控制单元用于对p c r 反应过程中的温度变化进行控制 是保证p c r 反应成功的关键 既要保证不同温区的独立 又要保证处于相同温区时 温度的均匀分砌 不同种类的p c r 反应单元所采用的温度控制方式也有 第二章p c r 生物芯h 的构成 所不同 1 对于微反应室类的芯片 其控制原理与常规的扩增仪相同 即将扩 增液至于反应室中 进行适当的温度热循环 但由于尺寸的极大缩小而大 大提高了温区转换的速度 无论是集成的或外嚣的热循环系统 所采用的 控温方式主要有 采用接触式电加热和风扇冷却相配合 这种方式虽然 有效的提高了冷却时的速度 但是整个装置的体积却很难缩小 使得控温 速率较慢 而且是不透明的不利于对芯片内的反应进行在片的检测 采 用红外线热源进行非接触加热 以钨灯作为红外辐射源 用压缩空气进行 制冷 这种方式的加热速率是l o s 冷却速率为2 0 s 但缺点是空间 占用大 变温气流循环系统 2 如图 2 3 所示 连续流动类芯片不需要在反应过程中改变温度 温度控制单元相对简单 只需将不同温区的温度保持不变即可 而且通过 在芯片上微加工出隔热带可减少各温区的热扩散作用 提高控温精度 控 温单元主要方式分为薄膜沉积式和外置式具体包括 将i t o 氧化铟锡 薄膜沉积在芯片的基片上 作为加热器 将带状的金膜沉积在i t o 薄膜的 两侧作为电极 通过直流电源对i t o 薄膜进 t t d n 热 将铂电极薄膜沉积 在基片上 直接用外部电源迸 7 7 自n 热 将铂薄膜沉积在基片上作为加热 器 用铝薄膜作为电极 由独立加热快组成的外置加热系统 剀 2 3 连续流式p c r 微流控芯片温控单元 f i g 2 3 t e m p e r a t u r ec o n t r o l l e rf o rc o n t i n u o u sf l o wp c rb i o c h i p 5 在线监测系统是用于对微流体的流动状态进行监测提供有关流体在微通道 北京工业大学工学硕士学位论文 内的信息及流动参数 确保正确的微流控操作 通常使用的观测设备有体 视镜 显微镜及c c d 显微摄像设备等 通过在流体中加入有色物质或荧光 染料使得流体滚动可视纯 从丽对遁道内流体豹流动状态 进行直接规测 6 p c r 扩增的结果是否准确可靠 还需要检测单元来验证 微流控芯片系 统中的检测系统是用于测定被分析样品经过相应的反应后有关组分的组 成及含量 按其原理可分为光学检测 表化学盆测 质谱裣测和核磁共振 检测等 第三章准分子激光加工p m m a 基微流路的研究 第三章准分子激光加工p m m a 基微流路的研究 3 1 p c r 微流控芯片材料的发展 目前 p c r 微流控芯片的基片大多采用硅 玻璃或硅一玻璃 由于硅导热性好 而且各向异型腐蚀的刻蚀程度容易控制 因此成为目前最常用的p c r 微流控芯 片基片 但是 由于硅的光学和电学特性 使其无法进行直接光学检测和与毛细 管电泳匹配 从而限制了它的应用 而玻璃具有透明 荧光背景低 不导电 价 廉 加工简单 易封接等优点 被广泛采用作为微流控芯片的基片 但是作为 p c r 微流控芯片 由于玻璃的导热系数小 导热慢 不利于温度控制 因此 很多时候采用硅 玻璃合用的形式 而且这些材料的生物兼容性都很差 其表面 对p c r 反应有抑制作用 因此 需要对其表面进行处理使其钝化 目前 高聚 物材料出于具有生物兼容性好 造价低等优势 成为最具竞争力的材料 如表 3 1 所示 表 3 一i 芯片利料对比 f i g 3 1 m a t e r i a l sf o rb i o c h i p s 材料种类优点缺点 单品硅 具有化学惰性和热稳定性易碎 价格贵 加工工岂成熟 司使用光刻和蚀 不能透过紫外光 电绝缘性能不够好 刻等制需集成l u 路的成熟t 岂 表面化学行为较复杂 进行加 下发批量生产 玻璃耳九 英 很好的屯渗性质难以得到深宽比人的通道 优良的光学性质加工成本较商 n 用化学方法进行表面改性键合难度较大 町用光刻和蚀袭 技术进行加工 柯耵l 聚合物 成奉低 品种多坷i 耐高温 能通过可见与紫外光导热系数低 础用化学方法进行表面改性 表表面改性的方法待进一步研究 面生物兼容性好 北京工业大学丁学硕卜学位论文 3 2 准分子激光微加工原理 在高聚物基片上制作微通道的技术有模塑法 热压法 l i g a 技术和软光刻 等吼这些方法均难以满足灵活加工复杂微通道的要求 而准分子激光微加工技 术则能够按加工轨迹和结构要求进行动态移动刻蚀操作 较大幅度的节约时间简 化制作步骤 提高生产效率 3 2 1 准分子激光刻蚀高聚物的内在机理 自从1 9 8 2 年发现当脉冲紫外光辐射固体有机聚合物表面时可自发去除材料 的现象后 这一加工方式就开始被大量的应用到微电子 外科手术 光学等多种 领域 而且也引发了对于这种 光分解刻蚀 a b l a t i v ep h o t o d e c o m p o s i t i o n a p d 过程的内在物理和化学原理的分析 2 1 2 2 在所采用的各种紫外激光中准分子激光 是被应用最多的光源 出于刻蚀过程中对于材料上未被刻蚀部分的热影响可忽略 不计 因此准分子激光加工被看作是一种冷加工 并且能够得到平滑的刻蚀表面 但是对于准分子激光与聚合物材料之间的相互作用机理仍然存在着争论 问 题主要集中在光解刻蚀过程是光化学过程还是光热过程或是两者并存的过程 以 及激光能量 波长等参数与刻蚀率间的关系 和对于刻蚀闽值的分析 在本文的研究中 主要从激光加工参数与刻蚀效果间关系的角度结合现有的 理论模型对准分子激光刻蚀弱吸收聚合物的机理进行了分析 光化学过程认为 出于准分子激光具有很高的光子能量 高于部分聚合物的 结合键能 在激光辐射的范围内 在材料吸收的光子流量超过闽值后 实现光解 并产生化学键的断裂 但断键数量不断增加 碎片达到一定的浓度时 被刻蚀材 料的体内压力和温度的急剧升高导致发生体爆炸 使得碎片离开基体 形成刻蚀 在光热过程的解释中认为 材料在被去除前 由于吸收紫外光光子能量产生 电子和振动激励 导致温度的急剧升高并使得材料发生蒸发爆炸 实现刻蚀 由 于高聚物的热扩散很小 使得刻蚀仅发生在表面层 对周围材料的影响很小 目前 在对紫外光刻蚀高聚物的研究过程中 人们发现至少在短波长段 2 0 0 n m 时 a p d 过程则可以通过快速热传导来解释 第三章准分予激光栅i t p m m a 基微流路的研究 3 2 2 准分子激光刻蚀高聚物的定量分析 按照不同的理论基础 对刻蚀过程的定量分析主要存在以下几种不同的数学 模型 本文也将结合具体的实验数据对这些不同的模型进行分析和讨论 1 光化学过程理论模型 从定量分析的角度 b r a n n o n 田1 等从光化学过程的角度出发 将刻蚀过程分 解为两步 光吸收和材料刻蚀的