与细胞中(p)ppGpp相关的环境胁迫信号感知和应激反应.doc

细胞发育生物学综述 与细胞中(p)ppGpp相关的环境胁迫信号感知和应激反应与细胞中(p)ppGpp相关的环境胁迫信号感知和应激反应2120141293 王德美摘要(p)ppGpp，即鸟苷五磷酸或鸟苷四磷酸盐，是细菌细胞内的一种小分子信号物质，其合成和分解均由RelA/SpoT蛋白家族或Rel/Spo双功能蛋白调控。RelA/SpoT蛋白家族或Rel/Spo双功能蛋白可感知环境胁迫条件并通过(p)ppGpp代谢调控诱导细胞发生应激反应，如DNA 复制受阻、rRNA合成抑制及降解、基因的差别表达以及代谢酶的激活或抑制。关键词 环境胁迫信号；互惠调控；应激反应；转录抑制及激活正文一、(p)ppGpp催化活性蛋白1.(p)ppGpp催化活性蛋白的功能在大肠杆菌和其他变形菌纲细菌细胞，RelA和SpoT酶家族严谨调控(p)ppGpp代谢。RelA 为核糖体蛋白，催化合成pppGpp或ppGpp合成。SpoT为胞质蛋白，在有Mn2+存在时，具有(p)ppGpp 水解酶活性和微弱的合成酶活性。而在一些革兰氏阳性菌以及蓝细菌细胞，染色体上含有Rel/spo同源基因，可编码具有(p)ppGpp 合成酶和水解酶双重功能的Rel/Spo同源蛋白(RSH)。胞内(p)ppGpp合成酶活性蛋白通过对环境胁迫的感知和催化调控信号分子(p)ppGpp合成的引发细胞应激反应的发生【1】。2.(p)ppGpp催化活性蛋白对环境胁迫信号的感知2.1 RelA/SpoT酶家族对环境胁迫信号的感知2.1.1感知氨基酸饥饿的机制在大肠杆菌中，当氨基酸缺乏时，非氨酰基化的tRNA 结合于核糖体的A 位点阻滞蛋白质的合成，多肽延伸时核糖体空置反应诱导RelA 合成(p)ppGpp。2.1.2感知脂肪酸饥饿的机制酰基载体蛋白(ACP)结合于SpoT 的TGS 结构域（可能具有调控与核苷类配体结合的功能）， 细胞中非酰基化ACP和酰基化ACP的比率可能影响这种结合。因此，脂肪酸饥饿改变SpoT 两种催化活性的平衡并导致合成酶活性升高， (p)ppGpp积累。2.1.3感知其他营养胁迫的机制SpoT 感知其他营养胁迫的机制可能更为复杂。如磷饥饿时， SpoT 的合成酶活性升高， 细胞积累(p)ppGpp； 在磷源充足条件下， 适配蛋白RssB 将生长稳定期转录因子s (RpoS)运送至蛋白酶ClpXP 并使其降解。但在抗RssB 的抗适配蛋白IraP 存在时RssB 活性被抑制， 阻止s 被蛋白酶ClpXP 降解， 因此IraP 可中和RssB 并激活RpoS 循环。磷饥饿时， SpoT 合成(p)ppGpp， 由此增加IraP的转录并提高s 的稳定性， 并通过激活s 控制的基因的转录使细胞适应磷饥饿胁迫【2】。2.2双重功能Rel/Spo同源蛋白对环境信号的感知双重功能的Rel/Spo活性调控可能具有与RelA相同的信号感知能力。尽管核糖体的结构已非常清楚， 但RSH 与核糖体之间的相互作用所知甚少。实验得知结核分枝杆菌的Rel羧基末端的点突变或缺失突变降低对核糖体空置反应有激活作用，表明其合成酶活性的激活信号由其亚基的羧基末端传递到氨基末端，二聚体的形成可能与这种激活作用有关【3】。3. (p)ppGpp合成酶活性蛋白调控的分子机制3.1RelA/SpoT蛋白家族 RelA/SpoT蛋白家族氨基末端具有合成结构域(Catalytic domain， CAD) 和水解结构域(Hydrolysis domain， HD)， 羧基末端有TGS(Threonyl-tRNA Synthetase-GTPase-SpoT proteins，TGS) 结构域和ACT (Aspartate kinase-chorismate mutase-TyrA， ACT)结构域。TGS 结构域可能具有调控与核苷类配体结合的功能； ACT 结构域与特异性的配体如核苷酸等结合、调控酶的活性。RelA 中有CAD、TGS 和ACT，没有HD， 因此仅具有合成酶活性。SpoT 的氨基酸序列与RelA 高度相似， 其序列限制合成酶活性但不影响水解酶活性SpoT蛋白【4】。3.2Rel/Spo双功能酶3.2.1Rel/Spo双功能酶的晶体结构通过多波长激光散射实验和杂核磁共振实验，得到的停乳链球菌似马亚种细菌的晶体结构表明，双功能酶由两个不对称的亚基组成。每个亚基有一个双功能催化片段，其中包括两个酶功能相关结构，有两个互惠的活性状态，即“(p)ppGpp水解酶开/(p)ppGpp合成酶关”状态和“(p)ppGpp水解酶关/(p)ppGpp合成酶开”状态。 (p)ppGpp水解酶和合成酶结构域分别与环磷酸二酯酶和核苷酸转移酶超家族相似。大量实验表明，这两种互惠的拮抗催化反应和配体诱导的信号分子有关【5】。3.2.2核苷类物质与双功能酶的结合双功能蛋白的两个不对称亚基没有结构域的同源性，它们的水解酶配体结合位点和合成酶GDP结合模式均不相同，同时在相应活性位点的拓扑学结构具有多样性。当其中一个亚基（m1）的合成位点与GDP结合而水解位点未被结合时，另一个亚基(m2)的合成位点虽然与GDP结合但是不能有效进行催化反应。ppGp是一种ppGpp的衍生物，以经被证实在应激反应中是RNA稳定合成的强烈抑制剂。实验表明ppGpp和ppGp均可抑制嘌呤生物合成过途径中的IMP脱氢酶和琥珀酸腺嘌呤合成酶活性，其中ppGp的抑制能力更强。进一步研究发现，由ppGpp生成的ppG2：3p与琥珀酸腺嘌呤合成酶的亲和力至少比ppGpp大三个数量级，这似乎可以说明ppGpp可能通过水解活性位点的竞争抑制和合成活性位点的变构抑制作用抑制Rel/Spo蛋白的活性【6】。3.2.3催化活性的互惠调控Rel/Spo双功能酶的两个功能相反位点同时具有活性，在ATP过量的时候避免无意义的(p)ppGpp合成和水解的循环反应，或者在(p)ppGpp水平上加速对环境的适应。Relseq 的C端与核糖体结合，感知未氨酰化的tRNA的存在，与两个活性位点的互惠调控有关，向催化功能片段中添加Relseq可同时使水解酶的活性增强50倍，合成酶的活性减弱25倍。这说明这两个功能相反的催化位点之间具有串联的可能性。这种串联一旦被破坏，会使两个催化活性位点之一选择性失活。另一方面，两个活性位点之一与核苷酸类似物（如，-）的结合会使另一个位点失活。只有少数几种酶可以分别调控这两个活性位点，其中有的通过共加修饰发挥作用，然而这种方式需要充足的能量，因而并不经济【7】。二、(p)ppGpp介导的细胞应激反应细菌细胞内(p)ppGpp 水平的变化可导致一系列重要生命过程的改变， 如转录的抑制及激活、DNA 复制受阻、以及代谢酶的激活或抑制等。1.转录的抑制及激活 (p)ppGpp作用靶点是RNA 聚合酶，大多数的转录调控因子是通过与启动子或启动子附近区域的结合调控RNA 聚合酶(RNAP)的转录功能。但是 (p)ppGpp 不需要与调控序列或其他转录调控因子相互作用，而是直接与RNAP 结合调控转录。(p)ppGpp 转录抑制作用的一种可能的机制是(p)ppGpp 与DksA 一起降低RNAP 与DNA形成开放复合体的稳定性， 从而抑制如rRNA 启动子的转录【8】； 另一种可能的机制是RNAP 被(p)ppGpp 诱捕在封闭的复合体中， 不能启动转录。 (p)ppGpp 的转录激活作用主要包两种激活机制模型，一种是直接激活模型， (p)ppGpp和DksA 刺激RNAP 与DNA 形成稳定开放复合体的速率。直接机制也可能通过(p)ppGpp 促进持家Sigma 因子70 与RNAP 核心的亲和力而激活转录。另一种是间接激活机制通过(p)ppGpp 激活胞内由其他Sigma 因子S、H、N和E指导的基因转录。(p)ppGpp 改变持家Sigma因子70 与RNAP 核心的亲和力， 并提高其他Sigma因子与RNAP 结合的能力【9】。2.抑制DNA复制在大肠杆菌中(p)ppGpp抑制DNA复制过程的引发，ppGpp对应激反应的诱导能力比(p)ppGpp。然而在枯草芽孢杆菌中(p)ppGpp通过抑制引物酶的活性，抑制DNA合成过程中链的延伸，而且不受复制叉在染色体上的位置影响。值得注意的是引物酶的活性抑制直接受(p)ppGpp影响，但和GTP水平没有关系，而且ppGpp的抑制效果比pppGpp强得多。这与大肠杆菌中多含ppGpp而枯草杆菌中多含pppGpp的实验结论一致【10】。3.与核糖体蛋白相互作用已经证实(p)ppGpp可以与从嗜热芽孢杆菌中分离的起始因子2（IF-2）特异性结合，可在试管反应中抑制转录机制【11】。由于在转录过程中(p)ppGpp与GTP结合，所以人们猜想(p)ppGpp可以通过和GTP与IF-2结合的竞争来调节生长。除了IF-2，其他核糖体相关GTP结合蛋白也可通过感知细胞内GTP或(p)ppGpp的含量参与应激反应控制。霍乱弧菌中的CgtA与Obg是同源蛋白，能与SpoT反应来维持细胞内(p)ppGpp的低浓度水平从而防止应激反应的发生。这种阻遏因子使得霍乱弧菌的CgtA成为野生菌的必要蛋白，但是在对于变异菌株来说没有必要。相似地，在大肠杆菌中Der蛋白旨在RelA阳性菌株中才必要【12】。参考文献【1】 Patrick H., The suppression of defective translation by ppGpp and its role in the stringent responseJ,Cell, 1978, 14:545-557.【2】 Bougdour A.and Gottesman S.,ppGpp regulation of RpoS degradation via anti-adaptor protein IraPJ, Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(31): 1289612901.【3】 Avarbock A., Avarbock D.and Teh J., Functional regulation of the opposing (p)ppGpp Synthetase / hydrolase activities of RelMtb from Mycobacterium tuberculosisJ, Biochemistry, 2005, 44(29): 99139923.【4】 Potrykus K.and Cashel M., (p)ppGpp: still magicalJ? 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