HPLC法测定注射用盐酸万古霉素含量.doc

HPLC法测定注射用盐酸万古霉素的含量庄权权（泉州市第一医院药剂科，泉州市 362000）摘要：目的：建立测定注射用盐酸万古霉素含量的高效液相色谱法。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18(250mm4.6mm)，以0.025mol/L磷酸二氢钾缓冲液甲醇（80：20）为流动相，检测波长为230nm，流速0.7ml/min，柱温40。结果：在5mg/L80mg/L范围内，万古霉素浓度与峰面积的线性关系良好（r=0.9999），高中低3种浓度的加样回收率为98.65%101.7%，相对标准差为0.10%0.98%。结论：所建立的方法准确、简便，适用于注射用盐酸万古霉素的质量控制。关键词 HPLC 盐酸万古霉素 含量测定万古霉素是一种糖肽类抗生素。其作用机制是以高亲和力结合到敏感细菌细胞壁细胞前体肽聚末端的丙氨酸，阻断构成细菌细胞壁的高分子肽聚糖合成，导致细胞壁缺损而杀灭细菌。此外，它也可能通过改变细菌细胞膜渗透性，并选择性地抑制RNA的合成1。 万古霉素抗菌谱窄，抗菌活性强，疗效确凿，属杀菌剂。它口服不易吸收，主要分布于血浆，可透入各体腔和胎儿体内，但不易进入房水，佷少在体内代谢，主要在肾内排泄，血液透析和膜膜透析不能清除此类药物。万古霉素对革兰阳性球菌（肠球菌除外），敏感的阳性杆菌及厌氧阳性球菌和阳性杆菌均呈杀菌作用，为杀菌药。万古霉素对肠球菌呈抑菌作用，对肠球菌需在氨基糖苷类抗生素协同作用下才呈杀菌作用2，但近年来万古霉素不良反应屡有报道,如休克、过敏样症状、急性肾衰、粒细胞减少等3-6。对重症病人、长期使用本药患者、低出生体重儿、新生儿和幼儿与可引起肾、听力损害的药物（氨基糖苷类抗生素等）联合的患者应控制其血药浓度7。本文建立了注射用盐酸万古霉素含量反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。该法简便、准确，适用于注射用盐酸万古霉素的质量控制。1 材料与方法1.1 仪器 LC-20A液相色谱仪（日本岛津公司）；LC-solution色谱工作站（日本岛津公司）；SPD-10Avp紫外检测器；CP225D型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；KO-100DB超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；Simplicity超纯水系统（美国Millipore公司）。1.2 试药 万古霉素对照品（中国药品生物制品检定所，规格：100mg，批号：0360200301）；注射用盐酸万古霉素（Eli Lilly Japan K.K，规格：0.5g，批号：MW19231）；甲醇为色谱醇；水为重蒸馏水；磷酸二氢钾等试剂均为分析纯。1.3 色谱条件与系统适应性8 色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18(250mm4.6mm)；流动相为0.025mol/L磷酸二氢钾缓冲液甲醇（80：20），检测波长为230nm，流速0.7ml/min，柱温40，进样量：20l。1.4 对照品溶液的制备 精密称取万古霉素对照品约10mg，置25ml量瓶中，加10ml双蒸水溶解后，再加磷酸二氢钾缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。1.5 供试品溶液的制备 取0.5g注射用盐酸万古霉素，精密称定，置25ml量瓶中，加10ml双蒸水溶解后，再加磷酸二氢钾缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。1.6 线性关系考察 取万古霉素对照品适量，精密称定，用磷酸二氢钾缓冲液溶解制备成5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L系列浓度溶液，按上述色谱条件，进行含量测定。1.7 精密度试验 取万古霉素对照品适量，精密称定，用流动相制成含万古霉素5mg/L、20mg/L、80mg/L的溶液，分别精密吸取20l注入液相色谱仪，重复进样5次。1.8 稳定性试验 按“1.4”项方法制备样品溶液，分别于0、0.5、1、2、4h取样，精密量取20l注入液相色谱仪测定。1.9 重复性试验 按“1.5”项方法平行制备6份同一样品溶液测定含量。1.10 回收率试验 于空白辅料中，按处方量加入万古霉素对照品适量，用流动相制成低、中、高三种浓度万古霉素溶液（5mg/L、20mg/L、80mg/L），按外标法分别测定并计算回收率及RSD。2 结果2.1 色谱条件与系统适应性试验 在此色谱条件下，对照品和样品中万古霉素与其相邻色谱峰的分离度均1.5，理论半数(n)按万古霉素峰计算不低于2000。供试品、对照品及空白辅料色谱图分别见图1、图2及图3。 A B C 图1 高效液相色谱图A.万古霉素供试品；B.万古霉素对照品；C；空白辅料2.2 线性关系考察以峰面积(y)对溶液浓度（x）进行线性回归，得回归方程y=（1.95596e0.05）x（10.1418）（r=0.9999）,结果表明：在5mg/L80mg/L范围内，万古霉素浓度与峰面积的线性关系良好。2.3 精密度试验 RSD=0.53%（n=5），说明仪器精密度良好。2.4 稳定性试验 RSD=1.10%，说明万古霉素在4小时内稳定性良好。2.5 重复性试验 RSD=0.97%，说明本法重复性良好。2.6 回收率试验 回收率均在95.0105.0之间，RSD（），表明本方法的回收率良好。结果见表1。表1.回收试验结果加入量（mg/L）回收量（mg/L）回收率（%）平均回收率（）RSD(%)RSD(%)5.05.02100.4%5.05.03100.6%100.530.11%5.05.03100.6%20.019.7598.75%20.019.7798.85%98.750.10%0.9920.019.7398.65%80.079.8199.76%80.081.22101.53%100.400.98%80.079.9299.9%3 讨论3.1我们取万古霉素对照品适量，加流动相溶解后，进行紫外扫描（200400nm），发现万古霉素在230nm波长处有最大吸收，空白对照试验表明，溶剂在230nm波长处有极弱吸收，且保留时间短，不干扰主要成分和有关物质的检查，故选择230nm为检测波长。3.2 在试验过程中，我们选择1.0ml/min流速时，液相色谱仪器柱压达4Mpa，影响柱子使用寿命，低流速又影响出峰时间，经过试验比较，确定流速为0.7ml/min。3.3 柱温高低影响万古霉素的出峰时间，柱温升高，出峰时间加快，柱温过高又影响柱子使用寿命，通过试验，确定柱温为40，不影响万古霉素分离度。3.4 试验表明，pH值及盐浓度对万古霉素的峰位及柱效有一定的影响，但对杂质检出及改善峰对称性影响不大。同时由于高浓度的盐对柱效损耗较大，经过多次摸索和比较，发现以0.025mol/L磷酸二氢钾溶液：甲醇（80：20）为流动相峰型好，柱效高，各峰之间分离较好，故选此作为流动相。3.5 万古霉素注射液在4h之内稳定性良好，建议医护人员现配现用，以避免其降解，影响用药安全。本次测定结果亦表明反相高效液相色谱法准确、简便，适用于注射用盐酸万古霉素的质量控制。参考文献1 陈新谦主编.新编药物学M.北京：人民卫生出版社，2007：1.2 张象麟主编.药物临床信息参考M.四川：四川科学技术出版社，2007：53 闫正华,董亚琳,董海燕等.警惕万古霉素不良反应J.中国医院药学杂志,2001,21(9):553.4 诸林俏,黄晨,周璇等.万古霉素致急性肾衰1例J.医药导报,2010,29(3)：3055 王渊,韩冬.盐酸万古霉素致1例过敏反应分析J.首都医药,2010,05(下):676 杨沐，任伟.万古霉素静脉滴注致粒细胞减少J.药物不良反应,2009,11(2):1217 李昕，李焕德.万古霉素给药方案的研究进展J.中国药学杂志，2010,45(8):5615668 国家药典委员会主编.中华人民共和国药典（二部）S.2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录：2829.作者简介 庄权权，男，硕士，药师，研究方向：临床药学电话E-mail:Determination of Vancomycin Hydrochloride for injection by HPLCQuanquan Zhuang(Dept.of Pharmacy，The First Hospital of Quan Zhou，QuanZhou，362000)ABSTRACT: OBJECTIVE:To establish an HPLC method for the determination of Vancomycin Hydrochloride.METHODS：RP-HPLC method was adopted. Shim-pack VP-ODS C18(250mm4.6mm) with UV detection at 230nm were used, and the mobile phase consisted of 0.025mol/L KaH2PO4-methanol(20：80)，the flow rate was 0.7 ml/min,the temperature of the column was 40.Results:The calibration curve was linear(r=0.9999) within the range of 5mg/L80mg/L for vancomycin,the average recovery was from 98.65% to 101.7% for three different levels of the amount vancomycin,Relative standard deviation was from 0.10% to 0.98%.Conclusio