实验一 菠萝蛋白酶的初级纯化及鉴定(陈).doc

实验一 菠萝蛋白酶的初级纯化及鉴定 一、 目的： 系统地学习和掌握蛋白质分离纯化技术的原理及实验技术。熟练掌握饱和硫酸铵沉淀法、透析法、测定蛋白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。 二、 原理： 要研究某种蛋白质的结构和功能，生产高生物活性的蛋白类激素、酶等，第一步工作就是从复杂的混合体系中分离（ Separation ）出蛋白质并且进行纯化（ Purification ）分析。 1 蛋白质分离纯化的一般程序： 选择一种目的蛋白质含量丰富、稳定性好的样品材料。 将蛋白质从样品中抽提出来。 确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。 建立灵敏、特异、精确的检测手段，分步测定蛋白质的含量，检验蛋白质的纯度。 在操作、分析过程中注意保护蛋白质的稳定性，防止变性。 2 蛋白质的分离纯化方法： 利用溶解度不同的分离纯化方法有：盐析法、 等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。 盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶（ Salting in ）。但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。这是因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。 用于盐析的中性盐通常有硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁等，而以硫酸铵为最佳，它在水中溶解度大而温度系数小（在 25 时，溶解度为 767g/L ；在 0 时，溶解度为 697g/L ） , 分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度可适当地将蛋白质分开。如鸡蛋清中的球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵中沉淀。 对于含有多种蛋白质或酶的混合液，可采取分段盐析的方法进行纯化。添加硫酸铵到所需浓度的方法有： （ 1 ）加饱和硫酸铵溶液，公式如下： V=V0（ S2 S1 /1-S1） 式中， V ：为需加入饱和硫酸铵的体积（ ml ）； V0：为原来溶液的体积（ ml ） ; S2：为需达到的硫酸铵饱和度； S1 ：为原来溶液的硫酸铵饱和度。 （ 2 ）将固体硫酸铵直接加入到原蛋白质溶液中，可从有关生物化学实验书附录中查“ 硫酸铵溶液饱和度计算表”，获得所需要添加的硫酸铵的量。 3 透析和超滤 透析（ Dialysis ）和超滤（ Utrafiltration ，超过滤）就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（ Semipermeable membrane ） , 而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，扎紧袋口放在蒸馏水或缓冲液中进行的。 透析时，不断更换透析外液，直到口袋内小分子物质降低到最小值为止。 超滤是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。超滤膜是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等高分子聚合物制成的多孔薄膜，截留的颗粒直径从 2-20nm ，相当于分子量 1000-5 x 105 。超滤技术不仅使蛋白质得以分离纯化，还达到浓缩的目的。超滤、浓缩、去热源、脱盐及富集病毒、细胞等工艺。4 菠萝蛋白酶活性测定 酪蛋白是一种蛋白质，它被菠萝蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定菠萝蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说菠萝蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。三.实验材料 新鲜菠萝（ 1个 约500g） 四.仪器设备 （ 1 ） 电力搅拌器（或家庭用的电力搅拌器）（ 2 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 3 ） 752 紫外分光光度计（石英比色杯）（ 4 ） 722分光光度计 (玻璃比色杯)（ 5 ） 磁力搅拌器（ 6 ） 水浴箱（ 7 ） 电子天平；台式天平（离心平衡用）（ 8 ） 剪刀（ 9 ）冰箱（ 10 ）蒸馏水瓶（ 25L 或 50L ）。 五.玻璃器皿 1 以组为单位 试管 （ 15个）， 100 mL 烧杯（ 2 个）， 200 mL 烧杯（ 1 个），吸管（ 2 个）、玻棒（ 1 个）， 移液管或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 个），滤纸（ 8cm ）， 100mL 量筒（ 1 个）。 2 全班共用 1000 mL 试剂瓶（ 7 个）， 250 mL 试剂瓶（ 3 个）， 1000mL 烧杯（ 4 个）， 2000 mL 朔料烧杯（ 2 个）， 500mL 量筒（ 2 个）。 六.实验试剂 1 盐析粗提酶液 （ 1 ） PBS. 0.1moL/L. 2000mL mL pH7.2. （ 2 ） PBS. 25mmoL/L. 1000mL mL pH7.2.（ 3 ） 固体硫酸铵 500g2 测酶活试剂 （ 1 ）酪蛋白 1% （ pI4.8 ） 100mL 用 0.1 mol/L PBS pH7.2 配 ,50-55 水浴溶解，不停搅拌，需 1h 才能溶解。 2g 酪蛋白（进口装） +200mLPBS 0.1 mol/L pH7.2 （ 2 ）激活剂 100mL （现配现用） 半胱氨酸 - 盐酸盐 20m mol/L 0.35g ， EDTA-Na 1m mol/L ， 加 0.1 mol/L PBS pH7.2 至 100mL （ 3 ） TCA （三氯乙酸） 5% 200mL3 、透析袋处理及试剂 用 dH2O 含 1 mmol/L EDTA-Na 或煮沸 10min; 或用 2%NaHCO 3 +1 m mol/L EDTA-Na 。镊子取出，用dH2O 漂洗 1-2 次，即可使用。旧的透析袋，用洗衣粉煮沸清洗，在煮沸消毒，反复清洗。重复上述步骤。 使用后，洗干净，用蒸馏水浸泡，于低温保存，或浸泡在 70% 的乙醇只，于低温保存。 七.实验步骤 1 粗酶提取 去皮生菠萝（每班一个） 400g+400ml PBS 0.1M pH7.2 电动搅拌 2-4 层纱布过滤于烧杯中 分装于离心管（ 50ml ） 平衡离心 4000rpm ， 15min 弃沉淀，取上清液 ，量体积 倒入小烧杯,分8份，每组1份 加固体（ NH 4 ）2SO4 盐析， 25% 饱和度（144g/L），缓慢加入 边加边搅拌至完全溶解，倒入离心管， 1 管 / 组 4 ， 1h （静置） 平衡离心， 4000rpm ， 15min 取沉淀，再加 20ml PBS 0.1M pH7.2 溶解，如果不能完全溶解，平衡后离心 4000rpm ， 10min 弃沉淀，留上清，进行酶活测定。另取2ml放入试管中冰箱保存，用于凝胶层析除盐用。2果实菠萝蛋白酶样品中蛋白质浓度的测定（每组）将菠萝蛋白酶粗提液进行1：5稀释，然后吸取1ml，放入具塞刻度试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分摇匀，放置2分钟后，以标准曲线第一管为参比（1ml PBS 0.1M pH7.2+5ml考马斯亮蓝），同样条件下比色，记录吸光度，并通过查标准曲线计算出粗酶液的蛋白质含量。粗酶液配制；根据测得的粗酶液的蛋白质含量，取粗酶1250ug，用25mmol/L pH7.2 PBS 定容至50ml。3 酶活测定方法（每组） 试剂 对照 实验一 实验二 TCA(mL) 激活剂、酪蛋白（ mL ） 1：5酶液（ mL ） 激活剂（ mL ） 3 1（激活剂） 0.5 0.5 1 （酪蛋白）0.5 0.5 1 0.5 0.5 37 10min 水浴 TCA(mL) 3 3 静置 10min 滤纸过滤 OD 275nm 石英比色杯 酶活单位：在上述条件下 (37 , 酶促反应 10min) ，每 10min 增加 0.01 个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（ U ）。4 透析去盐 把测酶活后所剩的酶蛋白吸到透析袋中 , 系紧 , 置于蒸馏水的 1000mL 的烧杯中 , 置于磁力搅拌机上 , 进行透析。每15min用BaCl检测，直到无沉淀产生时，停止透析。或静止透析 23 天。准备8支试管，每15min从烧杯中吸取2ml透析蒸馏水与试管中，用BaCl检测沉淀产生的情况，用“+”表示浑浊度。5 测透析后的蛋白质的含量方法同2果实菠萝蛋白酶样品中蛋白质浓度的测定（每组）八 . 实验结果分析 1、 各实验组进行分析，讨论实验结果