串珠镰刀菌FvBCK1调节细胞壁完整性分生孢子发育及色素的产生.doc

福建农林大学硕士学位论文串珠镰刀菌FvBCK1调节细胞壁完整性、分生孢子发育及色素的产生学 科 门 类：农 学一级学科名称：植物保护二级学科名称：植物病理学研 究 方 向：分子植物病理学研 究 生：陶 红指 导 老 师：鲁国东 教授 王宗华 研究员完 成 时 间：二0一二年四月 The Master Degree Thesis of Fujian Agriculture and Forestry UniversityFvBCK1, a BCK1 homolog, is required for cell wall integrity, microconidia development and pigments production in Fusarium verticillioidesSubject Category：AgronomyPrimary Subject: Plant protectionSecondary Subject: PhytopathologyResearch Direction: Molecular PhytopathologySupervisor: Prof. Dr. Guodong Lu Prof. Dr. Zonghua WangSubmitted Date: April, 2012College of Plant ProtectionFujian Agriculture and Forestry UniversityFuzhou, Fujian, P.R.China, 350002独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：目 录摘要IAbstractII第一章 综述11.1 MAP kinase 信号途径在植物病原菌中的作用11.1.1 Fus3和Kss1 MAPK途径11.1.2 Hog1 MAPK 途径41.1.3 Mpk1细胞壁完整性途径61.2 植物病原菌串珠镰刀菌71.3 本研究的目的和意义8第二章 材料与方法102.1 实验材料和试剂102.1.1 供试菌株102.1.2 致病性鉴定材料102.1.3 常用生化试剂102.1.4 抗生素102.1.5培养基及配方112.2 实验方法112.2.1 串珠镰刀菌中MAPKKK FvBCK1的生物信息学分析串珠镰刀菌的FvBck1 串珠镰刀菌的MAPKKK FvBck1结构域预测 六种真菌中MAPK级联元件同源蛋白的系统进化关系分析112.2.2基因敲除策略122.2.3 引物设计与PCR扩增反应 引物设计 PCR扩增反应142.2.4 PCR产物纯化142.2.5 TA克隆152.2.6酶切与连接152.2.7串珠镰刀菌FvBCK1基因敲除质粒载体的构建162.2.8串珠镰刀菌FvBCK1基因敲除突变体的互补162.2.9串珠镰刀菌突变体的初步筛选162.2.10反转录PCR、（RT-PCR）、基因FvBCK1表达验证和实时定量PCR反转录PCR基因FvBCK1表达验证实时定量PCR172.2.11串珠镰刀菌菌落生长速率的测定182.2.12串珠镰刀菌产孢测定182.2.13 串珠镰刀菌细胞壁敏感性测定182.2.14 串珠镰刀菌致病性测定18第三章 结果193.1 串珠镰刀菌中BCK1同源物的鉴定193.2 FvBCK1敲除突变体和互补转化子的产生203.3 FvBCK1缺失突变体的生长状况213.4 FvBCK1缺失突变体对细胞壁压力胁迫的敏感性223.5 山梨醇部分恢复FvBCK1缺失突变体的菌丝生长缺陷233.6 FvBCK1对产孢起重要作用243.7 FvBCK1参与色素的形成263.8 致病性分析27第四章 讨论28参考文献31附录37致谢48福建农林大学硕士毕业论文摘要BCK1为有丝分裂原蛋白激酶（MAPKKK）。在酿酒酵母中，BCK1是细胞壁完整性途径（CWI）的一重要组成元件。FvBCK1为在串珠镰刀菌中BCK1的可能同源蛋白。敲除FvBCK1导致串珠镰刀菌生长速率减慢，同时敲除突变体表现出对几丁质结合剂荧光增白剂（Calcofluor White）、还原剂（DTT）以及细胞壁降解酶和高温的敏感度提高。FvBCK1敲除突变体在修改的皮拉衣固体培养基上仅产生假头状小分生孢子，没有发现链状的小分生孢子。再者，该突变体与野生型相比，产生色素的量减少。将含有FvBCK1的自身启动子和开放阅读框（ORF）的基因转化到FvBCK1敲除突变体后，得到的互补转化子，不仅恢复了对细胞壁影响物的忍耐性，同时也恢复了产生链状分生孢子的能力，以及提高了色素的产量。综合起来，我们的结果表明，串珠镰刀菌中FvBCK1是细胞壁完整性途径级联的MAPKKK，参与维持细胞壁的完整性，分生孢子的发育及次生代谢途径（色素的产生）。关键词：细胞壁完整性（CWI）、Slt2p MAPK级联、色素AbstractFvBCK1 was predicted to encode mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK) in Fusarium verticillioides homologous to BCK1which is the component of CWI pathway in Saccharomyces cerevisiae. Targeted deletion of FvBCK1 resulted in the F. verticillioides growing slowly and showing severe sensitivity to chitin-binding agent Calcofluor White, reducing agent DTT，high temperature and cell wall-degrading enzyme. The FvBCK1 deletion mutant only produced microconidial fales heads, but no microconidial chains were detected on modified Bilais culture medium. Furthermore, the FvBCK1mutant failed to produce pigments as many as wild type strain. Complementation of the mutated gene restored its tolerance to cell wall-disturbing compounds, ability to produce microconidial chains and pigments. Taken together, our results suggest that FvBCK1 is an MAPKKK involved in maintaining cell wall integrity, micoconidia development, and secondary metabolism of F. verticillioides.Key words: CWI; Slt2p MAPK cascade; pigments49第一章 综述1.1 MAP kinase 信号途径在植物病原菌中的作用真菌能够广泛地生存在各种复杂的自然环境中与其细胞壁的重要贡献是密不可分的。由于细胞壁的动态机制和特殊结构，它保护着有机体细胞在不同环境胁迫下不被裂解，比如高温、盐碱和干旱。真菌识别环境变化的信号是通过普遍且保守的MAP kinase (MAPK)信号途径。酿酒酵母作为模式真核生物，该信号途径的作用已经非常清楚，其中三条MAP kinase途径分别由Fus3和Kss1、Hog1以及Slt2调控。1.1.1 Fus3和Kss1 MAPK途径Fus3 MAPK级联有性交配途径在酿酒酵母中已有详尽的研究。这条信号途径的激活开始于性激素与细胞表面的受体Ste2或Ste3结合，现已证实这两个受体的同源物在所有的已经做过实验的子囊真菌中都存在。虽然这些同源蛋白分子大小不同，但典型的结构域,例如7次跨膜的区域都非常保守。据先前报道1，担子菌Ustilago maydis没有Ste2的同源物，但存在两个Ste3的同源物Pra1和Pra2。一旦信息素结合在它的受体上就会激活G蛋白使亚基Gpa1脱离G蛋白亚基Ste4和Ste18。真菌的Ga蛋白基于结构可以分为三大类，酿酒酵母Gpa1和它在丝状真菌中的同源物归为第一类class I，两个在Schizosaccharomyces pombe中的Ga蛋白Gpa1和Gpa2分别归为第二类class II和第三类class III。酵母菌亚门的Gpa1同源物，它含有100个氨基酸残基的区域并不存在其他已研究过的真菌中。所有的Gpa1同系物为了锚定在质膜上，预测其在N末端的半胱氨酸残基被异戊烯化，N末端的甘氨酸被豆蔻酰化。根据近期的一个研究表明，Rhizopus oryzae有四个class I Ga蛋白RO3G_01120，RO3G_09475，RO3G_0005和RO3G_00875 2。最早预测的Class I成员RO3G_06003，它缺乏典型Ga蛋白N末端部位。异源三聚体G蛋白的亚基Ste4和Ste18与Ga脱离将信号传递给下游的元件。在大多数真菌中，除了R. oryzae外，发现Ste4和Ste18分别只有一个同系物。在R. oryzae中，每个亚基现已鉴定有四个同系物。与Ga相似，酵母菌亚门的G亚基在大小上与其他丝状真菌存在差异，所有的Ste18同系物为了锚定在质膜上都包含一个预测的异戊二烯基。亚基的下游，信号传送到鸟嘌呤核苷酸交换因子Cdc24上，激活G蛋白Cdc42。在所有真菌中，这两个蛋白都有明显的高度保守的同系物，除了R. oryzaee中这两个蛋白都含有两个同系物。Cdc42激活PAK-like蛋白激酶Ste20和转换器蛋白Ste50，这两个蛋白相互协作进一步激活下游的MAPK元件。U. maydis中Ste20的同系物Smu1含有N末端Cdc42结合结构域和C末端激酶结构域，然而它并非植物侵染和交配的必须元件。酿酒酵母Ste50的同系物在除了R. oryzae外的大多数真菌中都能找到。Ste50是一个连接着G偶联的Cdc42Ste20复合物和MAPKKK Ste11的转换器3。稻瘟病菌中同系物Mst50的SAM结构域是与Mst11互作，并且是附着胞形成的必要部位。有趣的是，担子菌U. maydis（Ubc2）和Cryptococcus neoformans的Ste50同系物的大小是其他的两倍并含有一个子囊菌Ste50蛋白没有的Src Homology 3 (SH3)结构域。U. maydis同系物Ubc2的缺失消弱了信息素应激反应和毒性，由此可知它的SH3结构域显然不参与形态建成，但它是致病所必需的。Bem1是SH3结构域蛋白，它连接Ste5MAPK级联复合物、上游激活子和下游的底物。在已经研究的真菌中Bem1同系物非常保守。但也有例外，R. oryzae有两个Bem1同系物，一个(RO3G_02285)含有Rho-GDI结构域，而另一个Bem1蛋白并没有这结构域。此外与异源二聚体形成有关的保守PB1结构域并不存在于Candida albicans, R. oryzae和U. maydis的Bem1同系物中。酿酒酵母信息素应激途径的MAPK组件包含MAPKKK Ste11，MAPKK Ste7和MAPK Fus3 4。Ste11在Fus3和Kss1及Hog1途径中的功能是分别是使MAPKKSte7和Pbs2磷酸化，它含有一个与Ste50互作的SAM结构域。除了Ashbya gossypii，Ste50的同系物在所有真菌中都是保守的。Fusarium graminearum，Magnaporthe oryzae，Neurospora crassa和R. oryzae的Ste11蛋白包含一个RA结构域，而这一特征在其他真菌的Ste11同系物中并不存在。在酿酒酵母中Ste50是Ste11的一个互作蛋白，它的RA结构域是通过与Cdc42的结合将Ste11局限在质膜的特定区域5。丝状真菌中Ste11的RA结构域的存在表明MAPKKK是通过与Cdc42的结合定位在质膜上。在酿酒酵母中，两个MAPKs调节着Ste7下游的两个截然不同的信号输出：其中一个Fus3，是有性交配所必须的；另外一个是Kss1，控制侵略性生长和假菌丝的形成。与Fus3对比，Kss1不能结合Ste5，但可以被Ste7激活。Fus3和Kss1的同系物在病原菌M. grisea，F. graminearum和U. maydis侵染寄主时发挥着重要的作用。例如R.Oryzae有两个Fus3 和 Kss1的同系物，但是功能还有待确定。支架蛋白Ste5在酵母信息素信号传递过程中起着重要的作用，能够将Ste11Ste7Fus3复合体征募在细胞膜上，并通过邻近效应、寡聚化和构象改变刺激磷酸化6。除了A. gossypii之外，Ste5的同源物可能通过现在还未知晓的信号元件来执行PAPK途径的脚手架功能。酵母中磷酸化的Fus3能够激活下游效应因子，比如Ste12、Far1或Sst2，最终导致细胞周期的停滞，极性化生长和特殊的融合管的形成。Ste12是信息素应激级联下游的一个重要的转录因子，能与下游信息素应激元件(PREs)结合，并激活目标基因的序列，与Tec1协作调节参与侵染性生长7。除了S. pombe和U. maydis外，已研究过的真菌的末端都有一个单拷贝的Ste12同系物。除了典型的N末端Ste-like结构域，丝状真菌中Ste12同系物C末端包含两个C2H2的锌指结构域，然而在酵母菌亚门却不存在这结构。虽然锌指结构域在Ste12的作用还不是很清楚，但是在稻瘟病菌中Mst12的Ste-ike区域和锌指结构域在侵染水稻和毒性方面不可缺少。而Far1在信息素应激反应中介导细胞周期的停滞，通过将G 亚基与极性确立机制联系，使细胞在交配期间极性生长8。Far1同系物在其他真菌中都有发现，除了S. pombe和R. oryzae。尽管序列的保守性低（1020%），但预测出来的Far1蛋白都有典型的环状锌指结构域。Sst2是GTPase-激活的G蛋白信号途径(RGS)的一个Gpa1调控因子，它能够降低对信息素的敏感性，并阻止非依赖受体交配途径的信号传导9。Sst2的同源物在已经研究过的真菌中都存在。R. oryzae中有两个Sst2的同系物，S. pombe Sst2（480 aa）比其他真菌的Sst2短（650780 aa）。所有的Sst2蛋白都有一个RGS结构域。但A. gossypii和C. albicans的Sst2蛋白却缺乏一个保守的DEP-like系列（残基数 50135），该序列是结合G蛋白偶联受体Ste2所必须的。酿酒酵母的丝状形成和假丝状菌丝的生长是由mucin-like蛋白Msb2激活的。Msb2有一个N末端信号肽，胞外的富集丝氨酸苏氨酸的重复序列，单跨膜结构域和在胞质中短的的尾巴（与下游元件Cdc42互作）10。这预测出来的Msb2蛋白虽然含有普遍存在的信号肽和跨膜区域，但胞外区域的氨基酸重复并不精确，含有大量的糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基，只能说明Msb2的O-糖基化作用是保守的。同样的，胞质中的氨基酸序列在丝状子囊菌中也很保守，这说明这个区域在胞间信号传递的作用上非常重要。另外一个是小GTP结合蛋白Ras2，它是Cdc42, Ste20和Kss1的上游的元件，是丝状形成和侵染性生长所必须的11。在C. albicans中，Ras通过调节MAPK和cAMP途径控制细胞形态建成和毒性。Ras2显性等位基因在稻瘟病菌中的表达能刺激野生型菌株在非诱导表面形成附着胞，但pmk1不行。这表明Ras2存在于Mst11Mst7Pmk1级联的上游。在酿酒酵母中，两个Kss1的核内底物Dig1和Dig2，能通过抑制Ste12活性负调控侵染性生长途径。除了亲缘关系很近的A. gossypii，在许多真菌中并没有发现Dig1和Dig2的同系物，这表明丝状真菌有一个非Dig1和Dig2介导的调控机制在操纵。在丝状形成和侵染性生长基因的激活下，Ste12与TEA/ATTS家族转录因子Tec1形成一个异源二聚体的应激反应元件(FREs)。这间接的说明病原真菌Tec1同系物有可能与毒性有关。C. albicans的Tec1同系物调控着菌丝的发育和毒性12。这一关系在S. pombe和丝状子囊菌F. graminearum，M. grisea和N. crassa中却没有发现。总之，大部分Fus3和Kss1 MAPK级联的元件在已研究过的真菌中都是很保守的，这其中包括担子菌和接合菌。当然信息素应激反应的脚手架蛋白Ste5和两个Ste12的调控因子Dig1和Dig2是例外。而且更值得我们关注的是接合菌R. oryzae中异源三聚体G蛋白亚基的多样性。1.1.2 Hog1 MAPK 途径HOG1途径介导对渗透压其他压力的应激反应13。在酿酒酵母，Hog1途径上游的两个分支在MAPKK Pbs2汇合。其中一支由组氨酸激酶组成的磷酸化系统、磷酸转移蛋白Ypd1和应激调控因子Ssk1构成。高渗透压激活Sln1，导致去磷酸化Ssk1的水平增高，MAPKKKs Ssk2和Ssk22、 MAPKK Pbs2和MAPK Hog1的磷酸化。Sln1是唯一一个存在于酵母中的组氨酸激酶蛋白，在其他真菌中则含有多个组氨酸激酶。含有Sln1的group VI的膜，不仅包含了典型的磷酸化受体、ATP-结合和应激调控因子区域，还含有两个跨膜结构域。在C. albicans中，同系物CaSLN1参与菌丝的形成和毒性14，而A. fumigatus同系物TcsB的缺失并没有明显的表型。但S. pombe，U. maydis和R. oryzae的基因组中并非含有任何groupVI类型的膜。与之相反，磷酸化蛋白和细胞质应激调控因子的同系物在所有菌中都存在。研究实验表明，缺失Ssk1的C. albicans突变体在侵染鼠科模式生物时没有毒性，并且不能黏附人类细胞15。N. crassa的RRG-1应激调控因子的同系物处在渗透压应激MAPK途径的上游，调控着无性发育、雌性生殖、渗透压抗性和对杀真菌剂抗性。MAPKKKs Ssk2和Ssk22能激活Sln1分支下游的MAPKK Pbs2和MAPK Hog1，已研究过的任何真菌都只含有一个Ssk2/ Ssk22的同系物，除了S. pombe含有两个以外。在另一条渗透感应分支中，质膜蛋白Sho1招募MAPKKK Ste11和MAPKK Pbs2停留在细胞表面。除了S. pombe和R. oryzae，研究过的真菌Sho1的同系物都表现出保守的结构特征。现已发现C. albicans的Sho1同系物调控着A. fumigatus菌丝生长、形态建成和氧胁迫适应性16。至此，Sho1同系物在植物病原菌中的作用还没有研究。与Fus3和Kss1途径相似，Ste11在渗透压应激途径的Sho1分支中被激活需要小G蛋白Cdc42、受体蛋白Ste50和PAK激酶Ste20。MAPKK Pbs2在HOG途径中行使支架的功能，并将上游的分支汇合。Ssk2和Ssk22在严重的渗透压胁迫下磷酸化Pbs2，而在不是很高的渗透压环境下却被Ste11激活，由此可以看出Pbs2在Sho1，Ste11和Hog1的互作中行使着支架的功能。除了A. fumigatus和其他Aspergilli含有两个同系物外，所有研究过的真菌只含有一个Hog1同系物17。在A. fumigatus中，两个Hog1同系物SakA和MpkC虽然在应对氧胁迫和营养缺陷时起重要作用，但是与毒性无关。同样，M. grisea中Hog1同系物Osm1缺失突变体表现出对渗透压胁迫更敏感，但是能形成附着胞，并且成功侵染水稻导致其致病。F. graminearum MAPKKK FgOs4，MAPKK FgOs5和MAPK FgOs2的基因敲除之后，发现色素产量增多、 而且也不能产生单端胞霉烯18。酿酒酵母中，Hog1的下游靶标包含MAPK-依赖的蛋白激酶Rck1和Rck219，转录因子Sko120，Msn2和Msn4 21， Hot1 22，Smp1和Rlm1 23和Mcm1 24。所有这些下游元件在真菌界都非常保守，除了Hot1。因为它的存在局限于酵母菌亚门。虽然R. oryzae有两个MADS-box转录因子Smp1，Rlm1和Mcm1的同系物，但在大多数情况下都发现这些元件的单一同系物。总之，除了转录因子Hot1外，Hog MAPK途径的元件在真菌界都很保守。1.1.3 Mpk1细胞壁完整性途径Mpk1细胞壁完整性途径级联是通过对细胞周期和外界环境的各种胁迫的应激反应的控制而改变细胞壁成分的比例。在酿酒酵母中，细胞壁偶联胁迫受体Mid2和Wsc1 25能激活Slt2/Mpk1途径，他们两者不仅能与Rho1的鸟苷酸交换因子(GEFs) Rom1和Rom2互作26，Mid2同样还能与细胞壁完整性蛋白Zeo1互作27。而这一互作仅局限在酵母属里。Wsc1 和Mid2一旦与鸟苷酸交换因子Rom1和Rom2结合，就会激活GTP酶Rho1。Wsc1、Wsc2、Wsc3的同系物存在于大多数的子囊菌中，并都含有一个保守的8个半胱氨酸细胞外的结构域。在Candida albicans中，GTP酶Rho1参与细胞壁的完整性28，土传致病菌尖胞镰刀菌的Rho1敲除突变体对寄主植物的毒力严重下降29。在酿酒酵母中Rho1的激活是由GEF Tus1和GTPase激活蛋白Sac7和Bem2调控，Tus1和Sac7在研究过的真菌中同系物很保守。Bem2在酵母菌亚门、U. maydis和R. oryzae中有发现，但是并没有出现在其他子囊菌中。在不同真菌中的不同分布的进化和功能还不是很明确，这种有趣的现象更值得我们去关注。在许多真菌病原菌中，这些同源物的作用已被证实了。Rho1激活蛋白激酶C1（PKC1），PKC1激活Mpk1 细胞壁完整性途径的组成元件MAPKKK (Bck1)，MAPKKs (Mkk1和Mkk2)和 MAPK (Slt2/Mpk1)30。R. oryzae有两个PKC1的同系物。The Aspergillus fumigatus BCK1的同源物Afbck1控制细胞信号途径、色素的形成以及对胁迫的应激31。稻瘟病菌的Bck1同源基因MCK1的缺失突变体菌丝会自我裂解，并表现出对细胞壁降解酶高度敏感性，同时失去在植物组织生长的能力32。在禾谷镰刀菌中，Slt2的同源基因Mgv1调控着与有性生殖相关的多核形成过程，并控制着植物的侵染和细胞壁的完整性33。在稻瘟病菌中，Mps1是细胞壁完整性、产孢和寄主侵染必不可少的基因34。C. albicans 在高温下的生长、形态转变和致病性都由Slt2的同源物Mkc1调控35. Slt2/Mpk1调控着许多下游核内靶标，包括SBF（细胞周期依赖的基因的转录激活子）36、MADS-box转录因子 Rlm1 （在酵母中至少调控着25个基因，其中大部分参与细胞壁的合成与功能）37和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶Ppz1 和 Ppz2（调控着K+和 pH的稳定，决定了细胞的盐耐受性、细胞壁完整性和细胞周期进程）38。因为进化的多样性，真菌细胞壁的结构和功能还不是了解得很透彻。再者，不同真菌的在各种胁迫条件下，其细胞壁的合成和调控机制不同。尽管细胞壁完整性途径的Slt2/Mpk1级联在真菌中，像裂殖酵母、牙殖酵母和丝状真菌等，但是在不同真菌间它们的功能还是存在差异的。1.2 植物病原菌串珠镰刀菌在分类学上，镰刀菌的无性时期属于半知菌亚门，有性时期为子囊菌亚门。自从1809年Link首先在锦葵科植物上发现第一株镰刀菌以来，镰刀菌的种类现在已经发现了44种，以及变种大约7个。它们分布范围极为广泛，但是大部分普遍存在土壤及动物、植物的有机体上，有些甚至存在严寒酷冷的北极和炎热干旱的沙漠地带，是属于兼寄生生活或着是腐生生活。串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides，有性态 Gibberella moniliformis)属于半知菌亚门，丝孢纲，瘤座孢目，瘤座孢科，镰刀菌属。串珠镰刀菌是分布广泛的病原菌，其寄主包括植物、动物以及人类。它能侵染玉米造成穗腐、茎腐和根腐以及枯萎病39，被侵染的植株生长不良，易倒伏，灌浆不饱满，一般会使农作物减产510，严重时甚至颗粒无收。串珠镰刀菌引起的病害导致寄主组织损害、产量下降、机械收割难，造成严重的经济损失。该病原菌通过种子传给后代40。此外，串珠镰刀菌还产生真菌毒素如伏马毒素等41。伏马毒素是水溶性次生代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的双酯化合物，它对人、畜是一种致癌物，食道癌与这种毒素相关，而且还主要损害肝肾功能，能引起猪肺水肿和马脑白质软化症等。因此伏马毒素残留在玉米中会严重危害牲畜和人类的健康。此外，串珠镰刀菌在不同的环境中产生不同色素，这不仅成为传统分类学的一个重要依据，也成为真菌免受高温、紫外线、重金属和抗真菌剂的伤害的保护剂42。真菌，如Aspergillus，Penicillium和Fusarium可以产生多样化的繁殖体，例如，菌丝片段、抗逆境结构如菌索和菌核、有性孢子和无性孢子。串珠镰刀菌则形成小型分生孢子，大小约为5-121.5-2.5um，呈纺锤形至棍棒形，有时可以具有一个分隔。小型分生孢子单出、侧生，在适宜的产胞条件下，小型分生孢子呈链状排列。串珠镰刀菌很少形成大型分生孢子，但是在绿豆培养基和康乃馨花瓣培养基上可以产生大量的大分生孢子，大型分生孢子为不对称的拟纺锤形，纤细，薄壁，具有伸长的常常是尖而弯曲的顶细胞和具有小柄的基部细胞，3-7个分隔，是在菌丝侧枝上的分生孢子梗上形成。菌丝与分生孢子不产生厚垣孢子。串珠镰刀菌的cAMP-protein kinase A PKA)途径参与分生孢子的形成。CPK1和FAC1 在串珠镰刀菌中分别是蛋白激酶A腺苷酸环化酶的催化亚基，这两个基因的突变体在生长和大分生孢子的形成上有缺陷。fac1突变体只能生成假头状的小分生孢子，其中的原因是FAC1的缺失导致两个疏水基因HYD1和HYD2 的表达量严重下降43，而这两个基因已被证实与串珠镰刀菌产分生孢子的方式有关44。1.3 本研究的目的和意义串珠镰刀菌是农业生产上非常重要的病原菌，严重威胁着农作物的产量、机械收割，造成严重的经济损失。本论文的出发点是通过研究MAPKinase信号通路中的元件找出与该菌的致病或者传播相关的基因，进而可以设计针对性强的药物抑制串珠镰刀菌的致病或致病性的蔓延。MAPKinase信号途径在酵母和稻瘟病菌中已研究得非常深入，它参与着有性生殖、无性繁殖和抵抗各种环境胁迫等等。先前的报道指出，MAPKinase信号途径中细胞壁完整性途径遭到破坏导致了稻瘟病菌（mck1）32的不致病和尖胞镰刀菌（rho1）45的毒力严重下降，但是对于串珠镰刀菌，细胞壁完整性的研究还没有人涉及，这也是我研究这一课题的原因。MAPKinase级联的组成元件在生物界虽然很保守，但是它的确存在差异，例如，在Botrytis cinerea和Colletotrichum lagenarium中，Slt2p途径虽然参与菌丝生长，分生孢子发育及致病性，但是不参与细胞壁完整性途径46。再如S. cerevisiae的BCK1是细胞壁完整性途径级联的MAPKKK，但是在与它亲缘关系非常近的K. lactis中却不参与细胞壁完整性途径47。真菌的细胞壁厚大约 100-250nm，它占整个细胞干物质的30%，其主要成分是多糖，多糖主要有葡聚糖、几丁质、甘露聚糖、纤维素等，其次是蛋白质、类脂。低等真菌的细胞壁成分以纤维素为主，酵母菌以葡聚糖为主，而高等真菌则以几丁质为主。一种真菌的细胞壁组分成分并不是固定不变的，它是随着生长阶段而不断变化的，因此不同阶段细胞壁的成分略有明显不同。真菌细胞壁的主要功能可以体现在很多方面，例如：它既可以维持细胞的整体形状，也可以控制细胞的生长，还可以增加细胞的机械强度；由于细胞壁处于细胞的最外层，它的存在就控制着物质的运输与信号的传递，只允许小分子（离子、多糖等）和低分子量的蛋白质透过，却成功地阻止大分子或微生物的进入；此外，病原菌的某些细胞壁成分调节着寄主的一些生理生理过程，进而有助于真菌的成功侵染。综上所述，在串珠镰刀菌中研究细胞壁完整性途径无论在生产上还是在基础的细胞生物学上都有很重要的意义。第二章 材料与方法2.1 实验材料和试剂2.1.1 供试菌株串珠镰刀菌野生型菌株：Fusarium verticillioides 7600串珠镰刀菌FvBCK1缺失突变体：Fvbck1-7 和Fvbck1-8串珠镰刀菌FvBCK1缺失突变体互补转化子：Fvbck1-com-1和Fvbck1-com-7大肠杆菌：Escherichia coli DH5所有菌株都保存在福建农林大学功能基因组学研究中心。2.1.2 致病性鉴定材料离体的玉米粒接种实验中所用的玉米品种均是福单2号。2.1.3 常用生化试剂Takara： PCR反应所用试剂（各种Taq酶、dNTP、10PCR Buffer），T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶OMEGA：胶回收试剂盒Promega：反转录试剂盒天根：荧光定量PCR试剂盒Roche：用于Souhtern杂交的地高辛标记试剂盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I深圳华大基因研究院：引物合成和DNA测序分析工作由完成其它常规试剂均为国药制剂。2.1.4 抗生素生工生物工程：氨苄青霉素Ampicilline，硫酸链霉素StreptomycinRoche：潮霉素B(Hygromycin B)Amresco：新霉素G418使用浓度分别为：氨苄青霉：100ug/ml，硫酸链霉：60 ug/ml，潮霉素B：200 ug/ml， 新霉素G418：200 ug/ml。2.1.5培养基及配方完全培养基Complete Medium (CM)：每升用量蔗糖10g，酵母抽提物6g，酸水解酪蛋白6g，琼脂粉20g（只有配固体培养基时才加入，起固化作用）。用于串珠镰刀菌的生长； Luria-Bertani培养基（LB）：每升用量胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母浸粉5g，琼脂粉20g，调PH至7.0，用于细菌的培养；TB3培养基：每升用量酵母浸粉6 g，酸水解酪蛋白6 g，蔗糖200 g，琼脂粉12 g，用于串珠镰刀菌原生质体的转化与再生；Joffe修改的皮拉衣（Bilais）培养基：每升用量硝酸钾1g，磷酸二氢氨1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，葡萄糖0.2g淀粉0.2g，琼脂20g，用于串珠镰刀菌产孢。2.2 实验方法2.2.1 串珠镰刀菌中MAPKKK FvBCK1的生物信息学分析串珠镰刀菌的FvBck1从真菌的模式菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的数据库中搜索得到BCK1的氨基酸序列，再将这段序列输入到到镰刀菌数据，用BLASTP搜索，即可得到已经测序的三种镰刀菌（串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌和尖胞镰刀菌）中相应的同源蛋白和基因号。其中串珠镰刀菌FvBCK1的基因号是FVEG05000.3。 串珠镰刀菌的MAPKKK FvBck1结构域预测将获得的串珠镰刀菌中FvBCK1氨基酸序列输入蛋白结构预测Prosite网站的工具中进行结构域和功能的预测。 六种真菌中MAPK级联元件同源蛋白的系统进化关系分析在串珠镰刀菌数据库(/)相似性比对发现BCK1的同源基因，然后我们通过氨基酸序列比对在/找到许多真菌的同源氨基酸序列，包括A. fumigatus, Ustilago maydis, Neurospora crassa, A. nidulans 和 M. oryzae。Bck1p的同源物和其他MAPK激酶Ste11p, Ssk2, 22p，运用ClustalX和TreeView软件构成一棵系统进化树。2.2.2基因敲除策略本研究运用DNA同源重组的原理进行目的基因的敲除。通过克隆目的基因FvEG05000.3上游和下游约1000bp的片段，然后再用潮霉素hph基因取代目的基因片段连接于目的基因上下游碱基序列的中间，导入串珠镰刀菌原生质体中从而同源重组达到敲除靶基因的目的。原理如（图2.1）。图2.1基因敲除策略Figure 2.1 Strategy of gene knockout.2.2.3 引物设计与PCR扩增反应 引物设计将需要扩增片段的DNA片段的碱基序列在镰刀菌数据库（Fusarium Comparative Database）中找出，本次试验需要扩增的序列包括FvBCK1、actin、FvTUB2、FvHYD1、 FvHYD2 ORF的部分序列，FvBCK1上下游约1000bp的序列，及即重组菌株中目的基因的上游和部分潮霉素序列, 获得DNA序列之后，运用Primer 5.0或者BeaconDesigner软件根据引物设计要求（荧光定量的引物用BeaconDesigner软件）设计特异性扩增目的片段的引物，必要时在引物的5需加上酶切位点接头。本次实验所用到的引物序列以及用途见表2.1，引物序列发送到深圳华大基因研究院，由其完成合成工作。表2.1.本实验中所用到的引物Table 2.1 Primers in the studyPrimersPurposeSequence 5 3B1FAmplification of the fragment upstream of FvBCK1 ORFAAggtaccGAAGAGGGCACAACACTTCAGAB1RTATaagcttTCAGGTTTATTCCGAGCCGTTAB2FAmplification of the fragment downstream of FvBCK1 ORFGGactagtAAAGGAGCCATAGATACACGATCB2RGAtctagaGAAGGTGGGCAAGAAGTATGB3FVerification of gene FvBCK1expressionTGGCTCAACGCTAGGCAGTTB3RAGGAGACAAGGATACAGGGAB4FVerification of FvBCK1 homologous replacementACACTCACCAATCCGTCCATB4RGACAGACGTCGCGGTGAGTTB5FAmplification of the fragment containing promoter and ORFGGGCAAGTGGGAGCTTAGCACAGACGATGAB5RCATCAGCCGTATCCAGCCGTTCATTTCATTACCActin FAmplify actin as endogenous controlCGATTCTGGTGATGGTGTTActin RACTCTTCCGTAGCAATGTCProbe FAmplify a fragment for probeGAAGAGGGCACAACACTTCAGAProbe RTCAGGTTTATTCCGAGCCGTTATub2-rt-FAmplify FvTUB2 gene as the endogenous controlCAGCGTTCCTGAGTTGACCCAACAGTub2-rt-RCTGGACGTTGCGCATCTGATCCTCGHYD1-rt-FAmplify FvHYD1 for measuring its expressionCCATTGATCAGATCACCGTCGHYD1-rt-FCTGAGAGCAATGCAAGGAAGGHYD2-rt-FAmplify FvHYD2 for measuringits expressionGCAACGGTCCCTCTATCTCCHYD2-rt-RGTTGCTGATAGCAACGCAAGG PCR扩增反应PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是指在DNA聚合酶催化下，以DNA链（基因组DNA、质粒DNA、cDNA）为模板，特定引物3为延伸起点，通过变性、退火、延伸步骤，体外进行约20-40个循环，复制出与模板特异片段一致的子链DNA的过程。PCR是一项DNA体外合成技术，能快速并且特异地在体外扩增任何目的DNA。PCR扩增体系如下：ddH2O：19.4 L10PCR Buffer：2.5 L引物-F（10 mM）：1.0 L引物-R（10 mM）：1.0 L2.5 mM dNTP：0.5 L模板：0.5 LTaq酶（5 U/L）：0.1L反应体系：25.0 LPCR热循环条件：目的温度时间预变性955min28-35循环变性941 min退火50-581 min延伸721-8 min补充延伸7210 min保存410 min取PCR扩增产物7L左右，加溴酚蓝2L，点样在1.0%琼脂糖凝胶，电泳检测，并拍照记录实验结果。2.2.4 PCR产物纯化试验中所有PCR产物的纯化都是使用的OMEGA公司的胶回收试剂盒，操作的具体步骤请查看该试剂盒内的说明书。2.2.5 TA克隆本试验采用Takara公司的T载体pMD18-T（附录 图1）进行TA克隆，克隆的参照体系为：PCR产物：2.0LT载体：0.5LSolution I：2.5L连接体系：5L将反应管置于16恒温水浴中连接反应1小时。2.2.6酶切与连接酶切反应体系如下：质粒DNA：X L10Buffer：4.0 L限制性内切酶1(20 U/L)：1.5 L限制性内切酶2(20 U/L)：1.5 L补ddH2O至：40.0 L质粒的用量需根据提取质粒的浓度而定，而最终的反应体系总体积40L由纯净水来补充；将反应管置于37恒温箱内酶切反应4小时左右，酶切结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。重组载体连接体系：10T4 DNA Ligase Buffer：1.0 L外源片段：x L 线性化载体：y LT4 DNA Ligase：0.5 LTotal10.0 Lx和y的用量需根据外源片段和线性化载体的浓度而定，浓度相当时，按3:1比例加入；反应管在16下连接12小时。2.2.7串珠镰刀菌FvBCK1基因敲除质粒载体的构建（1）以测序完成的串珠镰刀菌野生型菌株7600的基因组DNA为模板，用引物B1F和B1R经 PCR扩增出FVEG_05000编码框上游A片段（长度约为1.2kb）。（2） 经过Kpn和Hind 两种限制性内切酶充分消化后，连接插入至pCX62 （附录 图2）载体上的多克隆位点，得到重组载体pBCK11，转化到大肠杆菌Escherichia coli DH5。（3）用引物B2F和B