RT-PCR实验心得.doc

RT-PCR实验心得 提取RNA(我做细胞的)1.取中号培养瓶(100ml培养瓶 注:此时细胞汇合度80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzol（量大无防！）,细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管中.2.颠倒摇晃10下，室温5分钟.3.在2个EP管中各加入0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30C下孵育23分钟。4.在28C下用不超过12,000g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。5.用移液枪分别转上层水相（约500-600l）于另二个1.5mlEP管中,加等体积异丙醇（约500-600l），混匀室温10分钟来沉淀RNA在28C下以不超过12,000g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。6.舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4C或-20C) 1 ml来洗涤RNA沉淀在28C下以不超过7,500g的离心力高速冷冻离心5分钟。;离心前注意放管的方向,注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年!7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用20-50l DEPC水溶解。(建议装于0.6的EP管中.)8紫外光度检测注:该步后,可保存于-70超低温冰箱,或算好计量建立体系立即用于逆转录. RT反应体系注意事项1.RT试剂盒中试剂解冻后,摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作.2 PCR仪预热到50C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录.3反应体系准备:比原体系大10%;建立25ul的反应体系;先按总反应体系混合总体体系反应物,在分装于PCR管中(分装前宜离心!),再分别加 RNA和引物/内参;4 RNA的量宜大2ug/reaction!5 要有要有逆转录(50,30min)和初始热活化(95, 15 min);Reaction components for one-step RT-PCR using Q-Solution（我的一步法）ComponentVolume/reaction Final concentrationMaster mixRNase-free water (provided)5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer* 10.0/5 l1xdNTP Mix (containing 10 mM each dNTP)2.0/1 l400 M of each dNTP5x Q-Solution 10.0/5 l1xPrimer A 0.6 MPrimer B0.6 MQIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mixx 2.0 /1l Template RNA0.5/1 pg 1/2 g/reactionTotal volume 50.0/25ul_注:引物/内参在反应体系中的浓度为20M.反应体系要搞清!PCR反应体系steptimetemperatureReverse transcription30min50Initial PCR activation step15 min953-step cyclingDenaturationAnnealingExtensionNumber of cyclesFinal extensionGAPDH：(+)5-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3；/(-)5-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3扩增片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94 3 min，94 40 s、59度40 s、72度1 min 7个循环，94 40 s、56度40 s、72度1 min 25个循环，72延伸5 min。bcl-2:(+)5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3/(-)5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3 扩增片段长度为319bp。bcl-2扩增条件为944min，94 30s、63 30s、72 1min,33个循环,72 7min；bax扩增条件为945 min, 94 30s、63 30s、72 1min,94 1 min，31个循环, 72 7min。电泳1 电泳缓冲液: 0.5TBE:工作缓冲液0.5TBE,我的是10TBE的浓缩液, 100ml 的10TBE的浓缩液加入1900的三蒸水,既是为0.5TBE. 2、6缓冲液上样缓冲液(4保存)1.0% / 1.5%:琼脂糖凝胶的配制及用法: 找干净的容积大约为100ml的瓶子,加琼脂糖0.75g再加50ml电泳缓冲液(或:1.0g/1.5g琼脂糖+100ml电泳缓冲液)，微波炉中火60秒至沸腾，取出,熔化的琼脂物冷却,用1ml的移液枪,取琼脂糖凝胶封底后将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。(注意:加槽的注意事项(平行放;滴/泡沾缓冲液);取槽时的注意事项; 先取出凝胶盒,放侧板和梳子,在封底凝固后,到入凝胶,跑电泳时在取梳和侧板,此时凝胶和电泳液相混!注意不要有气泡! ) PCR产物电泳 取目的基因RT-PCR产物各10l及内参RT-PCR产物各5l加已点在纸上的(只要干净即可!)溴酸兰(即6缓冲液上样缓冲液)量大约1-2ul(量宜大不宜小,否则难以下沉)，反复吸打混匀(操作时注意事项:不要有气泡,关键是不要压枪到头!)用移液枪滴加到小槽内(操作的注意事项,伸入液面下,但不要碰到胶!) 后进行电泳! Maker的不加,直接移液枪滴加到小槽内.SYBRSYBRGreen I染色方法 1配制: 用PH 7.0 - 8.5 的缓冲液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀释SYBR Green浓缩液，混匀，制成染色溶液。TBE pH的要求:7.5 - 8.0 (最好pH 8.0).用水配稳定性不好(要在24h内用!)!配液时双层戴手套,试剂要常温解冻,离心再配! 2.保存:塑料和tip头盒中避光保存,不要放在玻璃容器中/染色屋最好设立单独房间.3.方法:将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。(可保存一周多,重复用4次!)为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。实验前期准备 预防RNA酶污染: * 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 * 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。 * 在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 其他注意事项 * 当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。 * 当TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加 入TRIZOL和氯仿后12,000g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。 * 离心前小心平衡试管。 * 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。 RNA抽提指南 注意：用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。所有的操作应该在15 -30的条件下完成，试剂亦在15-30的条件下。 实验前准备工作： 一实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l2、吸头：1ml、200l、20l3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20l吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100l6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20l10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大 17新开包的手套（全程戴!） 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、枪头盒、匀浆管等!）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1DEPC过夜，再烤干）玻璃器材180度干烤8小时. 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC!）三、试剂配制： 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20保存,或提前10分配好.（其中DEPC水需先高压!） 3、异丙醇：放入棕色瓶中. 4、氯仿：放入棕色瓶中.注:氯仿，无水乙醇，异丙醇均需重新开瓶，最好分装于几个EP管! 5、琼脂糖. *PBS均用用灭菌之DEPC水配制。 *Trizol，RT-PCR试剂盒 *无RNA酶的水或0.5% SDS溶液调配无RNA酶的水，将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01% (v/v ：体积比)。放置过夜并高压灭菌。SDS溶液必须用DEPC处理过并经高压灭菌的水配制。 四、几种缓冲液的配制： 1、电泳缓冲液： TAE Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml 5TBE （贮存液） 再将5TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水500ml 2006-9-15的收获 工作缓冲液