土壤中霉菌的分离.doc

土壤中霉菌的分离 、纯化基本实验小组成员：杜洪、任羽、蒋亚1.实验材料1.1试剂材料95%的乙醇、碳酸复红、无菌水、宜宾学院植物园中的土壤水溶液1.2仪器材料电磁炉、三角瓶、试管、接种环、接种针、载玻片、吸水纸、酒精灯、涂布棒、移液管、显微镜、擦镜纸、香柏油、培养皿、镊子等。1.3培养基【2】马丁氏培养基（400ml）葡萄糖 4g蛋白胨 1.5g1/3000孟加拉红水溶液 40ml无菌水 360mlKH2PO4 0.4gMgSO47H2O 0.2g琼脂 68gPH 自然112湿热灭菌30min。待培养基融化后冷却5560时加入链霉素稀释液30ml，使培养基中含链霉素30ug/ml。2.实验方法与步骤21取材及前期的灭菌工作211 前期的灭菌工作首先将内装有90ml的蒸馏水和8个玻璃珠的三角瓶、已配好的培养基、涂布棒、试管（内装9ml蒸馏水）5支、培养皿14个、1ml的移液管1支、0.1ml的移液管1支分开打包好，然后放入高压蒸汽灭菌锅进行常规高温灭菌，灭菌时间大概30分钟，灭菌完毕后拿出备用。212取样2008年11月19日到宜宾学院植物园取土壤，最好取种蔬菜的比较肥沃的土壤。22实验步骤2.2.1配制培养基【2】按马丁式培养基的配制方法称取试质并配成400ml的培养基。配方如下：葡萄糖 4g蛋白胨 1.5g1/3000孟加拉红水溶液 40ml无菌水 360mlKH2PO4 0.4gMgSO47H2O 0.2g琼脂 68gPH 自然112湿热灭菌30min。待培养基融化后冷却5560时加入链霉素稀释液30ml，使培养基中含链霉素30ug/ml。称取试剂时，先称取琼脂用清水搅拌均匀后，再依次加入其他试剂进行搅拌，边搅拌边加水煮沸，直到配置到400ml.2.2.2稀释将土壤样品10g加入90ml灭菌水中振荡20分钟，形成土壤悬浊液，取1ml土壤悬浊液加入装有9ml灭菌水试管中振荡即可形成10-2浓度的土壤稀释样液，如此依次将土壤样品稀释为10-3、10-4、10-5的土壤稀释液。2.2.3涂布平板将浓度为10-3、10-4、10-5的土壤悬浊液稀释样品分别涂布到已配制好的固体培养基平板上，每种浓度涂3个平板,而浓度为10-1、10-2的稀释液样品分别涂布一个平板即可。2.2.4培养将平板置于28。C恒温箱中培养两天，并经常观察细菌生长情况，避免细菌生长过快而难以分离提纯。2.2.5记数、形态观察观察记录每个培养皿中长出的细菌的种数以及细菌的菌落形态特征，记录优势菌2.2.6分离从平板中挑取单个优势菌落进行平板划线分离培养，培养2天。2.2.7纯化将划线长出的菌再进行平板划线分离培养，培养2天。2.2.8镜检对平板中的菌进行常规染色后显微镜下观察，并记录结果。2.2.9接种将纯化长出菌用画线法接到先前准备好的斜面试管培养基中培养。3实验结果刚开始时我们的细菌无法生长，于是我们再进行涂布培养，并且就我们的猜想对细菌进行了对照组培养，即多做了一组不加链霉素稀释液的培养基来培养菌种。结果是先前两种培养基中都无细菌生长，过一段时间后开始有细菌生长，对菌落进行计数，发现不加链霉素稀释液得培养基中长出了两种菌落，颜色为白色及青色，菌落表面干燥呈丝状；而加了链霉素稀释液的培养基长出了三种菌，颜色为白色、青色及黄色，菌落表面也为干燥呈丝状。可以得出，两种培养皿中长出了相同菌落，证明链霉素抑制了黄色细菌的生长。在显微镜下观察白色菌体，可发现菌丝透明细长;对长出黑色孢子的菌体进行孢子染色观察，可以看到孢子囊和细长的孢子梗。综上可以得出：我们分离出来得是霉菌，这两种菌是曲霉和青霉，而仍分辨不出黄色的菌体为何种放线菌。最后我们选择把纯的青霉进行试管斜面培养，得到了纯的青霉菌种。4.结果分析刚开始时所有的培养基中都没有任何细菌生长，我们进行分析后怀疑可能是加入的链霉素抑制细菌生长，于是制备了一组对照组。但后面发现没加入链霉素得培养基上也没有菌体生长，于是考虑所取的土壤中细菌得数量不多，稀释后没有多少细菌能在培养基上生长。我们再多等一天后发现开始两种培养基中发均有菌生长，并且无链霉素的培养基中长出两种细菌（如图一），而加链霉素的培养基中长出三种细菌且有两种和无链霉素的培养基中长出那两种细菌是一样的。于是我们认为是加入的链霉素对该不同菌种有抑制作用。而有些浓度的加有链霉素的培养基中只长出一种霉菌且是曲霉，我们认为一方面是加入的链霉素对细菌有抑制作用，另一方面是因为我们所取得土壤进行稀释后涂布在培养基上得到青霉菌种很少以致无法在每个培养基中生长出来。不能说明加有链霉素的培养基不长青霉就代表着链霉素抑制青霉的生长。白色的曲霉生长到一定时候开始长黑色的孢子（如图二），一段时间后观察到先前长白色菌体的培养