猪流行性腹泻的研究进展.doc

猪流行性腹泻病毒的研究和进展摘要：PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性肠道传染病。目前，PED在世界范围内广泛流行，给养猪业带来了严重的经济损失。广东省养猪业每年因此病造成的损失高达两千余万，特别是秋冬换季时，仔猪发病率高达49%，死亡率高达80%，约有70%的猪场受此病影响。 疫苗接种是预防治疗此病的方法之一。我国已研制出灭活疫苗、细胞弱毒苗、转基因植物疫苗、DNA疫苗等，给我国的猪市场带来了很好的预防措施。 关键词：猪流行性腹泻 基因 疫苗猪流行性腹泻（PED）是20世纪70年代在比利时、荷兰、捷克、英国、匈牙利等欧洲国家新发现的猪的一种肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。 由于PED与猪传染性胃肠炎（TGE）十分相似， 直到1977年从病料中分离到致病因子类冠状病毒，才确认这是一种独立的疾病， 并建议称作流行性腹泻病毒。在1981年美国出版的 猪病学 一书中， 将由冠状病毒引起的猪腹泻称之为猪流行性腹泻。1971年， 在我国上海地区也发生了以新生仔猪高死亡率，各种不同年龄品种剧烈腹泻为特征的传染病， 用各类抗生素和各种中西药物治疗都无济于事， 称作疑似传染性胃肠炎。 1980年， 用组织化学酶标技术证实此流行性泻病毒实质为PED。猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemicdiarrheavirus，PEDV）引起猪的一种急性肠道传染病。主要引起猪流行性腹泻。各种年龄、各个品种猪均可感染发病，哺乳仔猪、架子猪、育肥猪的发病率可达100%，成年母猪发病率为15%90%。其发病特点是：日龄小，症状重，日龄大，症状轻。1周龄哺乳仔猪常在腹泻34d后脱水死亡，病死率达50%。断奶猪、育肥猪症状较轻，腹泻可持续47d，成年猪仅发生呕吐和厌食。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）同属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，2种病毒感染后所引起发病猪的临床症状、流行特点和病理变化都极其相似，均给养猪业带来严重危害。当前PED发生率居高不下，发病情况也越来越复杂，出现混合感染的现象时有发生，目前倍受广大研究者的重视。PED在世界范围内广泛流行，尤其在韩国，日本和中国等亚洲国家。它给养猪业带来了严重的经济损失。PED造成猪的成活率减少、整齐度差、减缓生长速度、增重减少、推迟上市时间 、降低饲料利用率、增加额外消耗、降低牲畜抗病力、增加对细菌、病毒的易感性 、增加发病率，提高治疗费用 、牲畜脱水、休克、死亡 、猪拉稀体重下降等严重后果。1 病原学研究和流行病学研究PEDV具有冠状病毒科的所有形态特征。 从粪便中检到的病毒粒子呈多形态， 近似球形， 其直径 （含纤突）约95190nm，平均130nm， 纤突长1823nm， 规则地呈花瓣状排列。 许多粒子有不透明的核心， 由一半透明环与囊膜分开。 病猪是本病主要的传染源， 通过被感染猪只排出的粪便或病毒污染经口自然感染； PEDV随粪便排出后， 污染周围环境等也可散播传染。 消化道虽然是主要的传播途径， 但也有经呼吸道传播的报道。 自然感染后发病的潜伏期较长， 传播缓慢， 常在45周内传遍整个猪场。而PEDV口服人工感染的潜伏期为12d。 各种年龄的猪都能感染PED。 哺乳仔猪受害最严重， 病死率平均为50%。 PED有明显的季节性， 主要在冬季发生,也能发生于夏季或秋冬季节， 我国以12月到转年2月发生较多。PED单一发生或PED和TGE混合感染， 最近还有PEDV和PCV混合感染猪的报道。 比利时有7%的病猪是由PEDV引起； 我国26个省市、 自治区19871989年PED引起的死亡率是猪病总死亡率的1.74%， PED和TGE的混合感染率为21.2%， 而近2年来， 混合感染率高达30.77%。 PED自1971年发现以来， 比利时、 荷兰、德国、 瑞士、 韩国、 日本等国陆续有PED的报道。 我国的广东、 上海、辽宁、 青海、 黑龙江、 福建等地也发生过此病。2 发病机理研究证实，PDEV经口鼻感染后直接进入小肠，在小肠上皮细胞增殖，引起小肠绒毛吸收上皮细胞变性、损伤、脱落和小肠绒毛萎缩，导致肠内酶活性降低，吸收功能障碍，肠道内渗透压增高，引起渗透性腹泻。3 PEDV抗原性目前，经研究发现PEDV只存在一个血清型。病毒抗原也抗体的检测方法有很多种，有学者已利用ELISA、IFA、免疫电镜、免疫化学组织技术，原位杂交技术和血清学中和试验（SN）等方法检测PEDV的抗原和抗体，其中最敏感，迅速和可靠的检测方法是荧光抗体技术和IHC。经病毒中和试验和免疫荧光试验都可以证明，PEDV与冠状病毒家族其他成员并没用血清学交叉反应，因此，本病毒在抗原上与其他冠状病毒没用抗原关系。4 PEDV基因组结构PEDV的核酸基因组为ss(+)RNA,并具有感染性，其整个基因组全长大约27000nt-31000nt,如已测定出PEDV CV777株基因组全长为28033.PEDV的基因组结构与其他冠状病毒的很相似，在5端有一个帽子（cap）结构，3端有一个Poly（A）尾，主要是在胞浆中复制。其5端非翻译区（5UTR,296nt）位于基因1上游，其内包含有一个前导序列（L,65nt98nt）、一个AUG起始密码子、Kozak序列（GUUCaugC）和一个开放阅读框（ORG,编码12个氨基酸）。基因组3端非翻译区（3UTR,334nt）的末端连有Poly(A)序列，在Poly(A)上游的73nt处有一个含有8个碱基的保守序列（GGAAGAGC）,该序列在冠状病毒的所有成员中均存在，只是所在的位置有所不同。基因组中包含了由两个阅读框编码的两个病毒RNA聚合酶复核蛋白。PEDV四个主要的结构蛋白是由靠近3端三分之一的区域中的4个主要开放阅读框(ORF)编码，从5到3依次为纤突蛋白(S,4152nt)、小膜蛋白（E或sM，231nt）、糖膜蛋白（M，681nt）和核衣壳蛋白（N，1326nt）。位于sM（E）基因上游还有一个ORF3（675nt），其编码了一未知功能且具有多态性的产物。5 PEDV抗原表位研究PEDV S蛋白在介导感染宿主产生中和抗体的过程中发挥了重要作用。2002年Chang等据TGE S基因的中和表位序列，推测出了PEDV S基因的一个抗原表位区（499-638aa），并命名为COE,随后也被用于基因工程疫苗的制备。6 PEDV疫苗的研究6.1灭活疫苗灭活疫苗包括组织灭活疫苗和细胞灭活疫苗。由于组织灭活苗效果很好，目前应用最为广泛。哈尔滨兽医研究所、上海农科院牧医所和江苏农科院牧医所等单位试生产。细胞灭活苗制备方便，应用也越来越广泛。马思奇等研制的氢氧化铝细胞灭活疫苗的主动免疫试验和被动免疫试验的保护率分别为88.89%及90.7%，并研制了猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻病毒二联氢氧化铝细胞灭活疫苗，疫苗保存期1年。6.2细胞弱毒苗由于灭活苗产生完全免疫力需要2周时间，且剂量偏大，不利于紧急预防与降低疫苗费用，所以又研制了细胞弱毒苗。国外Park等将PEDV经Vero细胞致弱后的毒株DR13，通过口服和肌肉注射两种途径免疫晚期妊娠母猪，观察所产仔猪的发病率。结果口服免疫组的发病率（13%）远低于肌肉注射免疫组（60%），且口服免疫组仔猪抗PEDV的SIgA含量明显高于肌肉注射免疫组。研究表明，可应用PEDV细胞弱毒苗经口免疫晚期妊娠母猪，从而有效预防PEDV感染。6.3乳酸杆菌疫苗乳酸杆菌作为微生态制剂中的主要益生菌，广泛应用于食品、饲料加工业。构建乳酸杆菌质粒载体，表达在黏膜系统中增殖的病原微生物的保护性抗原基因，制备绿色环保、可食用的多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗应用前景广阔。而黏膜免疫恰恰是防治TGE和PED的主要途径。因此，研制刺激肠道黏膜免疫系统的TGE和PED基因工程乳酸杆菌疫苗有重要意义。目前，有的实验室正在开展乳酸杆菌表达TGEV、PEDV主要保护性抗原基因的研究。此研究拟从健康猪体内分离鉴定出乳酸杆菌，并进一步筛选出thyA基因缺陷型乳酸杆菌，构建含有TGEV或PEDV主要保护性抗原基因的以thyA基因为选择压力的非抗性乳酸杆菌表达载体，转化乳酸杆菌，制备基因工程乳酸杆菌疫苗。目前已筛选出2株thyA基因缺陷型乳酸杆菌，并已初步鉴定。TGEV、PEDV的S基因的克隆扩增工作亦已结束。2.4转基因植物疫苗Yang等将PEDV的S基因转入烟草中，提取转基因植物蛋白给小鼠注射，进行血清蚀斑减数中和测定，证明其具有免疫原性。给小鼠饲喂这种转基因植物可诱导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫。这些研究为研制PEDV口服转基因植物疫苗提供了新的思路。目前，在以烟草花叶病毒为载体的无烟碱烟草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表达，用表达蛋白免疫接种后，对仔猪具有良好的保护作用，为PEDV转基因植物疫苗的研究奠定了基础。2.5核酸疫苗核酸疫苗又称为基因疫苗、DNA疫苗，是20世纪90年代初从基因治疗研究领域发展起来的一种全新疫苗，与传统的弱毒或灭活疫苗相比，DNA疫苗具有不散毒、不返强的优点。DNA疫苗还具有可以制成标记性疫苗，便于临床诊断监测；疫苗性质稳定，便于储存和运输；应用范围广，不仅可用于传染病和寄生虫病的免疫预防，而且还能够用于肿瘤、自身免疫、过敏反应等疾病的治疗等优点。2.6多价联合疫苗TGEV和PEDV均属冠状病毒，致病机理相似，组织嗜性相同。因此，研制联苗亦是可行的。尤其在我国猪病毒性腹泻广泛流行，研制多联苗更是十分必要的。目前有TGEV与PEDV二联疫苗、PEDV、TGEV、RV三联灭活苗。参考文献：王明，马思奇，等猪流行性腹泻灭活疫苗的研究J中国畜禽传染病，1993，（5）：17-19余丽芸，侯喜林流行性腹泻病毒M基因与甲病毒载体重组RNA的构建J动物医学进展，2005，26（5）：73-76马思奇，王明，冯力，等