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文档简介

1、淋巴细胞的来源：人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。2、密度梯度离心法： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.0751.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。3、实验方法：1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）3、20，1500r/min，离心30min从上一次至下稀释的血浆、血小板PBMCFicoll红细胞、粒细胞4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。7.适量的培养基重悬细胞 ，计数。分离单个核细胞纯度为95%淋巴细胞约占90%95%4、 淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤23次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法 去除PBMC中混杂的血小板。 （三）单核细胞和粒细胞的去除 1粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙 毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。2羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。3苯丙氨酸甲酯去除法原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。5、 淋巴细胞亚群的分离 原理：根据相应细胞的特性和不同的标志加
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