叶绿素的测定.doc

分光光度法测青菜中的叶绿素（食品化学）艾克拜尔艾海提 s100102105 食硕1003一、实验目的1. 掌握水果蔬菜等食品中的叶绿素测定原理与操作方法；2. 了解叶绿素a和b的性质及各自的最大吸收峰；3. 熟悉分光光度计的使用方法，了解其注意事项。二、实验原理将青菜叶中叶绿素萃取到丙酮中，然后将溶于丙酮中的叶录素转移到乙醚中，在指定的波长下，测定叶绿素-乙醚溶液的吸光度，然后根据公式计算青菜叶中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。三、实验试剂碳酸钙，无水硫酸钠，85%丙酮，乙醚四、实验步骤1. 称取30g新鲜青菜叶置于组织捣碎机中，然后加入0.1gCaCO3和85ml丙酮，在高速组织捣碎机中，在转速20000r/min下捣碎2min破碎青菜叶组织。2. 抽滤所得的匀浆，用少量85%丙酮多次洗涤残渣，直到残渣不带绿色为止，将溶液合并后用丙酮定容至500ml。3. 吸取25ml叶绿素-丙酮溶液，加入到含有25ml乙醚的分液漏斗中，然后加入50ml水，观察到所有叶绿素都转入上层乙醚相中，放出下层水相。4. 在另一只分液漏斗中加入50ml水，插入一只末端拉成小孔的玻璃管，将叶绿素-乙醚溶液注入玻璃管，溶液通过玻璃管末端小孔进入水相后再上升聚集在水相表面，入出下层水相，重复上述操作步骤五次，让溶于叶绿素-乙醚溶液中的丙酮转移到水相中。将乙醚层转移至容量瓶中。5. 将以上放出的下层水相合并，加入25ml乙醚，同上操作。将所得乙醚层也转移至容量瓶中。6. 用乙醚将叶绿素-乙醚溶液定容至100ml。7. 用少量无水Na2SO4吸收叶绿素-乙醚溶液中的水分。8. 在波长660.0nm 和642.5nm下，分别测定叶绿素-乙醚溶液的吸光度。五、数据处理1. 总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b（mg/L）的计算公式如下： 总叶绿素=7.12A660.0+16.8A642.5 叶绿素a=9.93A660.0-0.777A642.5叶绿素b=17.6A642.5-2.81A660.0 式中A660.0和16.8A642.5分别代表波长660.0nm 和642.5nm测定叶绿素-乙醚溶液所得的吸光度值。2. 计算样品中叶绿素的含量，表达为100g青菜叶中含有的叶绿素的mg数。六、实验结果及分析测定结果如下：A660.0=1.066 A642.5=0.337总叶绿素=7.12A660.0+16.8A642.5=7.121.066+16.80.337=13.92mg.L-1 叶绿素a=9.93A660.0-0.777A642.5=9.931.066-0.7770.337=10.32mg.L-1叶绿素b=17.6A642.5-2.81A660.0=17.60.337-2.811.066=2.94mg.L-1称取的是30g青菜叶，定容的总体积为100ml，所以30g菜叶中含有的总叶绿素为1.39mg,，叶绿素a为1.03mg，叶绿素b为0.29mg。表示为100g青菜叶中含有的叶绿素的mg数：总叶绿素的含量为4.64mg/100mg，叶绿素a的含量为3.43mg/100mg，绿素b的含量为0.97mg/100mg。七、思考题 1 在破碎青菜叶组织时，为什么要加入碳酸钙或碳酸钠？当青菜组织捣碎，细胞破裂后，叶绿素即游离出来。游离叶绿素很不稳定，在酸性条件下，生成橄榄绿色的脱镁叶绿素，碳酸钙或碳酸钠呈碱性，可中和酸，使叶绿素更加稳定。 2 为什么叶绿素测定时应尽可能在低温和避光的条件下进行？ 这是因为游离叶绿素很不稳定，对光或热较敏感，加热可使反应加速。因此叶绿素测定时应尽可能在低温和避光的条件下进行。3 叶绿素a和叶绿素b的结构有何不同？ 叶绿素a 叶绿素b从上图中可以看出，叶绿素a和叶绿素b在结构上基本类似，都含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”，镁原子居于卟啉环的中央。两者在结构上的区别仅在于3位上的取代基不同，叶绿素a含有一个甲基，而叶绿素b则含有一个甲醛基，二者都易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿中。另外两者的最长取代链不同。 4 叶绿素在酶、热、酸的作用下会发生什么变化？（1）酶促变化的直接作用：叶绿素酶催化叶绿素中的植醇酯键，产生脱植叶绿素。酶促变化的间接作用：如脂酶、蛋白酶破坏叶绿素脂蛋白复合体；