碱性磷酸酶米氏常数的测定.doc

碱性磷酸酶米氏常数的测定 目的与要求 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。原理 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(Vmax)，如图37所示。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = VmaxS/(Km+S) 上式中Vmax为最大反应速度，S为底物浓度，Km为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= Vmax/2时，Km =S。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此Km的单位以摩尔浓度(molL)表示。 Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度Vmax实际上不易准确测定，Km值也就不易准确测出。林-贝 (1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （Km +S）/ VmaxS或1/V = Km/ Vmax（1/S）+1/ Vmax此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以正确求得该酶的Km值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响 图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其Km值。可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下： 操作步骤 1底物浓度对酶促反应速度的影响（1） 取6支试管，作好标记。按下表操作。试剂（mL） 管 号 1 2 3 4 5 60.04mol/L 基质液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0pH10，0.1mol/L碳酸盐缓冲液 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70蒸馏水 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20 37水浴中保温5分钟血清 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10最终基质浓度 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00 (2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37水浴中准确保温15分钟。 (3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。 (4)各管分别加入0.3 4-氨基安替比林1.OmL，0.5 铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活性。 (5)以各管基质浓度的倒数1/S为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出Km值。 2. 酚标准曲线的绘制 （1） 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。试剂（mL） 1 2 3 4 5 60.1mg/mL 酚标准溶液 0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60 37水浴保温5min碱性溶液 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.100.3% 4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.00.5% 铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 (2)混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。 (3)以酚含量(g)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。结果与计算 在37保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量(g)即可算出酶活性。 100mL血清中酶活性 = 释放的酚量（1/0.1）100（1/1000）注意事项 1血清取量要准确 2标准曲线必须是过原点的一条直线试剂 10.04mol/L 基质液 称取磷酸苯二钠10.16g或无水磷酸苯二钠8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，并定容至1000mL，加入4mL氯仿防腐，置棕色瓶中，冰箱内保存可用一周。 20.1molL碳酸盐缓冲液pH10(37) 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。3碱性溶液 取0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaHC03各20mL，混合后加蒸馏水到 100mL。 40.5铁氰化钾 取铁氰化钾5g和硼酸15g各溶于400mL蒸馏水中，溶解后二液混合，再加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶中，暗处保存。 50.3 4-氨基安替比林 4-氨基安替比林0.3g及NaHC03 4.2g用蒸馏水溶解，并稀释至100mL，置棕色瓶中，4保存。6酚标准液(0.1mg/mL) a称取结晶酚1.50g，溶于0.1molL HCl，定容至1000mL为贮备液。 b标定：取25mL上述贮备液，加0.1molL NaOH 55mL，加热至65。再加入0.1mol/L碘液25.0mL，盖好放置30分钟，加浓HCl 5mL，再以0.1淀粉作指示剂，用0.1molL硫代硫酸钠滴定，反应如下： 3I2 + C6H5OH C6H2I3OH + 3HI I2 +2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 根据反应，3分子碘(Mw：254)与一分子酚(Mw：94)起作用，因此每毫升0.1mol/L碘液(含碘12.7m