北欧受试者中的研究.doc

黄斑色素和与年龄关联的黄斑退行性改变风险在北欧受试者中的研究目的.年龄和对侧眼重病是与年龄相关的黄斑退行性改变（AMD）的两个重要危险诱因。在此研究中，作者调查了一组来自北欧人口的受试者中某些可变因素与黄斑色素（MP）光密度的关系。方法.MP光密度的测量在一组46个年龄由21到81岁不等的拥有健康黄斑的受试者和另一组9个已知有诱因为对侧眼重病的高危险AMD但拥有健康眼睛的受试者中进行。第二组的每只眼睛基于依赖关联MP光学密度的公认变量（虹膜颜色，性别，吸烟习惯，年龄和圆锥形晶状体密度）与一个控制眼相配。结果.无眼科疾病的志愿者(右眼: r2=0.29, P=0.0006; 左眼: r2=0.29, P0.0001)的黄斑色素光学密度是伴随年龄衰退的。易感染AMD的健康眼中MP显著少于不易感染的健康眼(Wilcoxon符号秩检验 : P= 0.015)。结论.导致AMD的两个重要的危险因素与相关的MP缺失有关。这些结论与补充叶黄素和玉米黄素可能延迟，转化，或者改变这些疾病的进程的假说一致(Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001;42:439446)。与年龄相关黄斑退行性改变（AMD）是西方国家中“法定盲”的主要原因，他的患病率可能由于寿命增长而增加。尽管AMD的发病机理仍鲜为人知，但多数机制认为成因包括遗传因素，积累性光损伤，自由基损伤，和血液动力学过程。所有这些过程的作用都至少部分的归结于氧化性视网膜损伤。人类黄斑色素(MP)包括两个羟基类胡萝卜素：一个叶黄素(L)和一个玉米黄素(Z)，浓缩密集于中央凹。MP是破坏性蓝光的有效过滤器，该破坏性蓝光由于其吸收光谱和前受体定位导致光氧化性视网膜损伤。此外，L和Z是有效的抗氧化剂，可以阻断三线态光敏物质和单线态氧，进行自由基反应，并阻碍膜磷脂的过氧化反应。结果人们推测，MP对抗AMD。由于黄斑色素完全源于饮食，因此这个保护效应将有重要的卫生保健暗示。 有很多可变因素作为AMD的潜在风险因素被研究。其中包括：暴露于日光，烟草使用，光虹膜颜色，种族，遗传因素，女性性别，心肺疾病，饮食以及隐性远视。然而，在这些因素上仍存在相当大的争论，但对对侧眼AMD和增长的年龄这两个危险因素的结论是无可争议的。这些观察提示我们把MP光密度测量和年龄联系，并且比较有“健康”对侧眼的单侧新生血管性AMD受试者与配对眼无高危AMD风险受试者的MP密度测量结果。材料与方法研究对象健康受验者. 46个白人志愿者被招募。受试者身体健康，通过各种眼科检查未发现眼部疾病。如下数据记录每位受试者：年龄，性别，吸烟习惯，虹膜颜色（通过一个标准化虹膜照片观察分级为蓝-灰，淡褐色-绿色，或者褐色-黑色）以及圆锥形晶状体密度（晶状体混浊分类系统(LOCS III)）高危眼睛.9个一只眼睛有晚期新生血管AMD但对侧眼无黄斑异常（高危）的白人受试者被招募。新生血管性AMD诊断是根据国际ARM流行病学研究组织公布的标准，并要求阐明在现存的软脉网膜小疣中的脉络膜新生血管和/或色素的改变。每个高危眼都根据虹膜颜色，年龄（10年），吸烟习惯，性别，和圆锥形晶状体密度与一个可控受试者的眼睛匹配。之后MP光密度比照一个病例对照方法。配对过程被MP测量结果掩盖。此项目由Central Manchester 地方调查伦理委员会（Central Manchester Local Research Ethics Committee）受试者均已签订受试志愿书。tenets of the Declaration of Helsinki were observed. 黄斑色素的测量 仪器.黄斑色素密度使用异色质闪烁光度法(HFP)测量。测量仪器他处以有描述，此处简单图示于Figure 1。仪器由三通道自由观察(非麦克斯韦观察)的光学系统构成。通道1提供一个波长范围在1nm增量（带宽6nm）的任意匹配刺激物。通道2提供蓝色标准光,LED,输出峰值在476nm的光谱（以一分光光度计标度）。蓝色的LED产生一个亮度20 candlas（cd）/m2的刺激物，这提供趋近2.6 log 托兰(td)视网膜映光。通道1和2 用一个Y形玻璃纤维管叠加在不光滑白色半球形反射罩中心，提供测试刺激物。色温度滤器后的一个10W卤素灯进行背景照明(LEE滤光器201；Lee, Andover, UK;全色温度校正蓝光，钨光，3200-5700K)，提供1.9 log td背景光照。通道1和2各自包含一个马达笔驱动的活门，(AL20/10; Lectromed, Letchworth Garden City, UK), 允许解测试刺激物在二通道内交替。电脑程序控制匹配刺激物的波长和强度（通道1）。图1 ，简图代表用于产生异染色质闪烁刺激物的纤维光学仪器. L,非球形聚光透镜用于聚焦灯丝于单色器的入射夹缝;S,活门。程序.为了检测MP测量技术的可靠性并建立最适设置，我们在12个健康受试者中进行预备实验。伴随步骤说的5分钟暗适应后，会议开始。观察距离为30cm，致成0.95大小的一个刺激物，对侧眼经程序闭塞。受试者注视集中，之后增加通道1发光度（匹配刺激物）到一个25Hz频率明显闪烁光的水平，受试者被指定降低的匹配刺激物发光度直到感受不到闪烁光（第一无闪烁光点）。之后，受试者继续降低的发光度直到闪烁光再现，他/她此时增加发光度直到闪烁光又一次消除（第二无闪烁光点）。无闪烁光量程中点记为匹配发光度。当受试者不能完全消除闪烁光，则记录最小的闪烁光量程。当受试者注视目标定位于鼻偏心率6，此过程重复。12个受试者进行中心和外周注视测试，利用光密度测量450nm到560nm处吸光度，得出MP的吸收光谱，其中450到480采用10nm增量，480到560nm采用20nm增量。不同波长呈现出假散乱型，每个波长取3到6个读数。令我们满意的是，此测量MP光学密度方法可有效并可重复，后续关于记录匹配发光度的测量结果仅用476nm和560nm刺激物测试。在每个个案中，2个波长各提取五个读数。MP光密度的衍生MP光密度测量原理源于如下的HFP。一束接近于MP光谱光密度峰值（476nm）的蓝色标准光，与一束非色素吸收光（据称560nm）交互，当二者均衡后可察觉的发光度消除。MP通过一个相当于吸收入射光片段的因子在各种波长下降低中央视网膜的相对感受性。因此，由于MP在6.5偏心度是光学上不可探测的，从中心和周边观察获得的匹配发光度间差别可用于测量MP光密度。如果标准L467发光度恒定并且L1（匹配发光度）可变，MP的吸收光谱可通过下式求得：其中Lc是中心注视匹配发光度，Lp是外周注视的匹配发光度，DO是1nm波长比标准476nm波长的MP光密度差。在560nm处的吸收波谱规定为标准，因为在大于等于560nm时MP吸收度为0。MP光密度因此可计算为：饮食上类胡萝卜素摄取利用一个关于含类胡萝卜素食品的公布数据修改后的食品频率问卷调查（FFQ）会诊获得营养信息，饮食中摄入的L和Z可以被评估。没有关于食物获得季节性变化的测量，因为有数据显示MP光密度在恒定饮食的受试者中长期稳定，说明视网膜中类胡萝卜素的生物转换低。因为摄取的大多营养成分与总摄取能量正相关，营养价值被适当调整并且用1000卡路里每毫克表示。当使用营养强化剂，只有日常营养成分进行能量调整，之后增加到补充量。能量和营养价值从UK食物表中恢复。计算日常摄入的L和Z，作为食物营养组分部分重量消耗频率。数据分析用回归分析和变量分析(ANOVA)测试年龄联系。用非参数Wilcoxon符号秩检验统计比较高危眼和他们的配对眼，或者当数据来源于常态分布时用配对学生t-检验。MP测量的重复性和测试-再测试变化性，被表述为可重复的系数（2一个受试者的2变量）。此系数代表两个连续读数的差异值，或者两个区域，will lie with 0.95 probability.结果结果用平均值SD表示。黄斑色素黄斑色素吸光谱。HFP测出MP平均吸收光谱和个体吸收光谱与Wyszecki and Stiles复合曲线十分相似，这说明我们的实验是可靠的(Fig. 2)。重复性和内部变异性分别用重复系数0.08和0.09表示。图2. 12个志愿者平均吸收光谱(6 SD)的Wyszecki 和Stiles合成标准吸收光谱图3. 46个健康受试者的左右眼MP光密度.MP光密度眼间一致性良好(simple regression: r= 0.866; P0.0001)，左右眼最大偏差0.135.Reproducibility and intersession variability are given by the coefficients of repeatability of 0.08 and 0.09,respectively. 健康受试者健康无眼科疾病的46名志愿者年龄从21到81岁（平均值5118），男女比例为21：25，13人是现实吸烟者。按虹膜分为21人绿-灰，14人淡褐-绿，11人棕-黑。所有受试者的年龄和性别均无联系（ANOVA: P = 0.58），烟草使用者(P = 0.8), 或者虹膜颜色显著 (P= 0.07)。右眼MP的平均光密度值0.2890.156(范围0.0240.646)，左眼的相对值是0.2990.159（范围0.031-0.596）。MP光密度眼间一致性很好（单回归：r=0.866 P0.0001），左右眼最大差距为0.135，测量结果在统计学上类似于对侧眼（Wilcoxon符号秩检验：P=0.68 Fig. 3）。统计学数据显示观察到的MP光密度岁年龄显著下降（右眼：r=0.24,P=0.0006；左眼：r=0.29，P0.0001; Fig. 4）图4.46个健康受控受试者MP光密度和年龄的关系.观察MP光密度在统计学上年龄相关的显著下降. （右眼：r=0.24,P=0.0006；左眼：r=0.29，P0.0001）高危眼.九个易于感染AMD（高危眼）的健康受试者，呈现平均MP光密度0.1470.144（范围，0-0.346）.无黄斑疾病的健康双眼（标危眼）相应数据与年龄（0年），性别，虹膜颜色，吸烟习惯匹配，圆锥形晶状体密度为0.3110.206（0.027-0.724）。同年龄高危眼和标危眼在统计学上相似（配对学生t-检测：P=0.18）,核浑浊（0.18），核颜色（P=0.45），皮质浑浊（P=0.86），后囊下白内障（P=0.71；Table 1）。此外，高危眼和标危眼中MP测量的重复性类似。重复系数各自为0.1和0.12。令人关注的，中央凹周围匹配的发光度在标危眼和易感染AMD眼（高危眼：Lp=1.560.16；标危眼：Lp=1.650.19；Wilcoxon符号秩检验：P=0.26），显示外周介质波长和长波视锥细胞光谱敏感性在配对眼中类似。9个高危眼中的8个的MP比他们的配对眼少，而且差异显著（Wilcoxon符号秩检验：P=0.015 Table 1）。表 1.公认与MP光密度相关的因素细节高危眼 (n 5 9)标危眼 (n 5 9)性别, 虹膜颜色,和香烟的使用AgeNoNcCPMPODAgeNoNcCPMPOD女, 淡褐-绿, 吸烟者6122110.03611.92000.72男, 棕, 吸烟者732.52.81.01.00.0722.52.24.01.00.03女, 棕色, 吸烟者662.12.01.00.90.18581.50.80.50.50.37女, 棕色, 非吸烟者762.02.00.20.20.32732.32.70.81.00.4男,蓝,吸烟者722.52.81.50.80.0682.52.51.01.00.17男,蓝-灰,非吸烟者672.72.90.50.50.19652.42.70.70.70.26男, 蓝灰, 非吸烟者712.22.01.01.00.35783.03.21.02.50.47男, 淡褐-绿, 非吸烟者813.33.02.83.00.27712.21.80.20.20.21男, 蓝, 非吸烟者682.22.50.20.20.0662.52.20.20.30.18No, 核浑浊; Nc, 核颜色; C, 皮质性内障; P, 后囊下白内障; MPOD,MP光密度.膳食类胡萝卜素46个健康受试者饮食摄取L和Z的平均日绝对能量调整值见表1。L，Z和这些类胡萝卜素的中间复合体以及MP光密度的绝对摄取和调整能量值之间没有明显的差别(Table 2; Figs. 5, 6)。拥有易感染AMD的健康眼受试者和匹配受控眼受试者在类胡萝卜素饮食消耗对照中，L、Z、类胡萝卜素类似物、或者L和Z化合物的绝对或者能量调整摄取没有统计学上的严重差异(Table 3)。 表2日常饮食摄取的L和Z变量绝对饮食摄取（mg/天）能量调整饮食摄取(mg/1000 kcal 每天)L和Z3.7 3.50.015 0.013L2.9 2.70.012 0.01Z0.82 0.230.003 0.001数据用均值SD表示。摄取量用在46健康受试者中进行的改良的饮食频率问卷评估。在绝对摄入或能量调整摄入的L,Z,或这两种类胡萝卜素化合物与MP光密度间无可论证关系(单回归分析. 绝对饮食摄入. L: r2=0.017, P=0.38; Z: r2=0.007, P=0.95; L+Z: r2=0.016, P=0.4;能量调整饮食摄取: L: r2=0.027, P=0.27; Z: r2=0.002, P=0.92; L+Z: r2=0.025, P=0.3).图5 46个健康志愿者的绝对日常饮食摄取的L和Z（mg）与MP光密度的关系图6 46个健康志愿者的能量调整日常摄取的L和Z (mg/1000 kcal 每天)与MP光密度的关系讨论在这项研究中，我们对46个健康受试者使用一种自由观测的HFP来测量MP的光密度，证实了，在一组北欧人种中，随着年龄的增长，色素光密度随之下降的现象。此外，我们还发现，相对于9只健康的眼睛，已知高危AMD的9只眼睛中MP极少。这项研究中MP的平均光密度为0.2890.156，相对于最近在亚利桑那州对217个对象进行的测量要高出一些（0.220.13），但是相比之前的大多数报道都是接近得。对于我们测量的结果与亚利桑那州的研究结果之间的差异有两种可能的解释。一是，Hammond和CarusoAvery所使用的MP测量方式是仅仅在4的视黄醛离心率基础上进行的，在那种条件下MP依然是肉眼可见的，因此得到稍低的测量值并不意外。第二，本试验中的所有试验对象都是从小就在英格兰西北部生活的，那里的光照水平要远低于亚利桑那州；并且MP的消耗可能是对更加大量的渐增曝光量产生的氧化剂的适应。本试验中试验对象个体间的MP测量差异范围在0.0124到0.6460.156，这和以前的报道是完全相符的。当前得结论表明，MP光密度随年龄增长的下降的现象与一些早期的研究结论相悖，但是和多数近期得研究结论是相一致的。有一点需要着重指出的是，早期的研究报告是没有顾及最近确定下来的确信是与MP光密度相关的一些变量的，比如，虹膜的颜色，吸烟，性别还有晶状体密度。Hammond和CarusoAvery在2000年曾经报道了，在亚利桑那州研究对象中，MP光密度与年龄在统计学意义上的反比关系（r=-0.14；P0.02）。可是，研究对象群体的年龄是否与MP密度相关的变量关联是不确定的。这是一个重要的细节，因为这种关联在那个研究中是确定了的。在当前的研究中，这些变量与年龄之间没有任何关系。很重要的一点是，年龄与Hammond和CarusoAvery研究的年限一定是有关系的，考虑到随年龄增长MP光密度下降可能归因于高水平外界环境光线的累积照射，我们在北欧人群中重新尝试了这个试验，发现有其他因素在其中发挥作用。MP光密度随年龄增长的下降与视网膜类胡萝卜素的摄入量不足或过度排空有关，MP光密度随年龄增长的下降也许仅仅是由于伴随年龄增长L和Z所在部位的光感受器和它们的轴突流失的关系，尤其是在Elsner等在视锥色素与MP之间的紧密空间关系证实的观点中。然而，因为视锥细胞在年龄相关损失中相对不足，又因为HFP技术排除视杆细胞功能，这个不太可能。另一种观点是，MP的用尽可能源于L和Z在应答伴随年龄增长的氧化剂负荷方面的利用。有数据证实微量营养元素缺乏在老龄人口中占据18%-40%，年龄相伴的MP下降可能有关营养方面。然而，由于饮食中类胡萝卜素摄取难预测量，导致报导的L和Z消耗值有广泛差异（0.8-4mg/天），这些很难调查。一个最近提出的著名研究认为，除L和Z外，老年人饮食摄取的类胡萝卜素和血清浓度之间显著正相关，这说明黄斑类胡萝卜素可能在这个年龄群体中吸收不当。此外，由于类胡萝卜素与a-生育酚及维生素C协同作用，缺乏任意一种维生素都导致类胡萝卜素 过度排空。去除饮食和吸收因素，也有可能主要是由于随年龄改变类胡萝卜素输送至血液过程以及视网膜的L与Z积累。9个AMD高危眼和9个无此风险眼，当配对眼基于MP光密度变量配对时，在8个易感染眼个案中，观察到的MP更少。近来，在Blue Mountains眼部研究（the Blue Mountains Eye Study）中调查了AMD的两侧对称性，报告指出，80%的早期或晚期AMD病人两眼感染。受试者中30例对侧眼有单侧新生血管性AMD，20例早期AMD（66%），7例萎缩性AMD（23%），只有3例拥有健康黄斑（10%）。第二只眼有单一侧新生血管性AMD的病人，由于显著伴随年龄增长的两侧新生血管性AMD，尽管按照各变量如年龄、吸烟情况和家族史进行了调整，仍具有高危发病条件。对侧眼中脉络膜新血管形成在单侧新生血管性AMD的个案中4年来发病率约为28%-35%，每年的发病风险为12%。这里报道的9个高危眼中的3个，软脉网膜小疣的色素在18周测试中改变，3个进一步显示这种改变有关脉络膜新生血管。眼部MP的缺失易导致AMD这个观点能够被本研究和先前研究中阐述的MP测量的眼间完美一致性很好的解释。换言之，新生血管性AMD病人对侧眼低MP光密度说明在患病眼中很可能是MP缺失，尽管后者由于维管组织瘢痕化并伴中心视觉丧失而不能被测量。此外，因为我们的配对眼以假定AMD危机因素的方式出现，而据报道AMD与MP光密度有关，观察到的易感染眼中MP缺失不依赖于高危AMD。然而，是否在疾病眼和健康眼中同样，MP缺少导致新生血管性AMD或者是亚临床疾病的根源值得商榷。MP定位于光感受器细胞或者膜某些部位，并且视锥细胞和视杆细胞系统在早期AMD中呈现出机能受损，因此推测很有可能是潜伏期AMD的光感受器缺失导致色素排空。然而，这种机制在我们的研究中不太可能很重要，因为易感染AMD眼与年龄相一致的控制眼在旁中心凹处敏感性一致，其中旁中心凹是AMD典型起源。此外，Curcio等在AMD的研究中显示不同的视杆细胞和视锥细胞损失，即在早期疾病中有不足的中心凹视锥细胞和相关不足的旁中心凹视锥细胞。所以简言之，由于健康的易感染眼没显示出临床疾病信号，并且视杆细胞因为我们使用25Hz频率测量而并不协助HFP测量，我们不相信光感受器失控学说作为我们在这些眼中所观察到的MP缺失的解释。此结论与Bone等的研究结果一致，他们发现AMD眼中，用高效液相色谱法（HPLC）测量的L和Z浓度在中央和周边视网膜上显著降低，说明视网膜类胡萝卜素缺失不是疾病过程的结果。然而有趣的是，一些易感染比某些标危眼拥有更多数目的MP。换句话说，我们的发现不支持AMD发展具有临界值的观点。第二，结果显示预成MP的排空也因此以至于视网膜类胡萝卜素用于响应一个年龄相关进程的氧化应激观点。显然，目前学说的主要限制是小样本量，这样反映出病人的健康对测眼较单一侧新生血管性AMD稀少。支持MP对抗AMD这个观点的证据可在别处得到。眼病个案-对照研究(EDCC)报道说，L和Z的高饮食摄入和高血清浓度可使AMD发展机会降低。Hammond等观察了几个推测的AMD风险因素和MP缺失之间的平衡，风