生理试验方法.doc

试 验 方 法1.SOD（超氧化物歧化酶）：氮蓝四唑法（NBT）法称0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L，PH7.8），冰浴研磨，研磨后再加1ml缓冲液，倒入离心管中，再用2ml缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（04）离心20min（10500rpm），离心后冷藏保存。取型号相同的试管，试管中加50L上清液(2支对照试管中各加磷酸缓冲液50L)，分别加3ml反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx日光下反应2030 min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。反应结束后，以不照光的对照管作空白，于560nm下比色测定吸光度值。磷酸缓冲液配制法：A：（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：Na2HPO42H2O35.61g或Na2HPO47H2O53.65g或Na2HPO412H2O71.64g，蒸馏水定容至1000mlB：（0.2mol/L NaH2PO4溶液）：NaH2PO4H2O 27.6g或NaH2PO42H2O31.21g，蒸馏水定容至1000ml0.1mol/L缓冲液配法A：x（ml）+B：y（ml）稀释至200ml；0.05mol/L稀释至400ml。 0.1 mol/Lx(ml)y(ml)PH0.05mol/Lx(ml)y(ml)PH12.387.76.061.039.07.084.016.07.591.58.57.891.58.57.894.75.38.0反应液：水：磷缓：Met：NBT：EDTA-Na2：FD（核黄素）5：30：6：6：6：6150ml反应液组成：水12.7ml+磷缓76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA-Na215.25ml+FD15.25ml 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：1.9399gMet用磷缓定容至100ml；750mol/L氮蓝四唑溶液：0.06133gNBT用磷缓定容至100ml，避光保存；100mol/L EDTANa2溶液：0.03721g EDTANa2用磷缓定容至1000ml；20mol/L核黄素溶液：0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。计算公式：以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为酶活性单位(U)SOD总活性（unitsg-1FW）(（Ack-AE）*V)/(0.5*Ack*W*Vt)SOD比活力(unitsmg-1Pr)= SOD总活性/蛋白质含量Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（4ml），ml；Vt为测定时样品用量，ml；W为测定时样品重量（0.5g）；蛋白质含量单位为mg/gFW。2.POD(过氧化物酶)：愈创木酚法取上清液20L加入比色杯中（对照加20L磷缓），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。反应液：0.1mol/L，PH6.0的磷缓50ml，加入愈创木酚28L，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30H2O219L存于冰箱中。计算公式：POD总活性(OD470min-1g-1FW)（OD470*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.02ml;W=0.5g；t1min) POD比活力（OD470min-1g-1Pr）总活性/蛋白质浓度3.CAT（过氧化氢酶）：取上清液100L加入比色杯中（对照加100L磷缓），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。反应液：0.1mol/L，PH7.0磷缓20ml，加0.1mol/L H2O25ml（5.68ml，30H2O2定容至1000ml）。计算公式：CAT总活性(OD240min-1g-1FW)（OD240*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) CAT比活力（OD240min-1g-1Pr）总活性/蛋白质浓度4.MDA（丙二醛）：取上清液1ml（对照加1ml水），加2ml0.67TBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000rpm下离心20min，取上清液于600nm、532nm、450nm下比色。0.67TBA：称0.67gTBA，加少量1mol/LNaOH溶液，再用10三氯乙酸定容至100ml。计算公式：C MDA（mol/L）6.45（A532A 600）0.56A450（消除糖类物质的干扰作用）MDA (mol/gFW)=C*V/W=0.1548(A532A 600)0.01344 A450(V=0.012L;W=0.5g)5.可溶性蛋白：考马斯亮兰G-250染色法取上清液20L（对照加20L水），加3ml考马斯亮兰，放置2min后，马上于595nm下比色。G-250：100mg溶于50ml，90的乙醇中，加入85（w/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常温下可放置一个月。标准曲线：Ypro（g）143.45OD+3.6（生）或143.56OD+1.28（园） 蛋白质含量（mg/gFW）（3*Y*V）/5*1000*a*W（Y标线值g；V酶液总体积4ml；a0.02ml；W0.05g；3/5由于标线是5ml中的含量，而本试验为3ml；1000将g变mg）6.ASP（抗坏血酸过氧化物酶）：抗坏血酸过氧化物酶（APX）：0.2ml酶提取液+2.8mlAPX反应液，290nm比色（10S/20S）。（E=2.8 mMcm-1）APX反应液：55 l 30% H2O2（1mM）+0.02359g ASA（0.25mM）+0.01994gEDTA-Na2（0.1mM），磷酸缓冲液（pH7.0）定容至500ml。取1.0g样品，加1ml提取液（磷酸缓冲液0.05mol/L，PH7.8；2mmol/LAsA；5mmol/LEDTA，现用现配），冰浴研磨，研磨后再加1ml提取液，倒入离心管中，再用2ml提取液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（04）离心20min（10000rpm）。取上清液100L加入比色杯中（对照加100L提取液），加3ml反应液，马上读290nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。反应液：50mmol/L磷缓，PH7.0；0.1mmol/LEDTA；0.1mmol/L H2O2，0.5 mmol/LAsA。计算公式：ASP总活性(OD290min-1g-1FW)（OD290*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=1.0g) ASP比活力（OD290min-1g-1Pr）总活性/蛋白质浓度7脯氨酸：0.5g鲜样（或0.05g干样），加5ml磺基水杨酸，封口沸水浴10min，冷却，用滤纸漏斗过滤，吸滤液2ml（对照吸蒸馏水2ml），加2ml冰乙酸，再加3ml酸性水合茚三酮显色液，沸水浴40min，冷却，加5ml甲苯，充分震荡，静置分层，取上层甲苯液于520nm下比色。3%磺基水杨酸：6g定容至200ml；2.5%酸性茚三酮显色液：（150ml用量）3.75g茚三酮+90ml冰乙酸+24ml磷酸+36ml蒸馏水（4下23日有效）标准曲线：Y脯氨酸=21.594OD-0.0785计算公式：脯氨酸（g/gFW或DW）=Y*V/a*W(Y由曲线查得；V提取液体积=5ml；a为测定时吸取的体积=2ml；W为样品重=0.5g)8.电导率：鲜样先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗2次，用打孔器打取圆片，取0.5g，装入大试管中，加入20ml蒸馏水，抽气3次，每次20min，第一次抽气后取出摇动，室温保持34h，多次摇动，测电导率S1，封口沸水浴10min，冷却（可用冷水冲泡），平衡10min后测S2，同时测定蒸馏水S0。计算公式：相对电导率（%）=100*（S1S0）/（S2S0）9.根系活力：根系去掉根尖和上部老根，取根0.40.5g，剪成2cm长的段，放入试管中，对照先加2ml，1mol/L的H2SO4，其余试管中加0.4%TTC和磷缓（1/15mol/L，PH7.0）等体积混合10ml，封口，放入37恒温箱中4h，取出，除对照外，其余加2ml，1mol/L的H2SO4终止反应，放置15min后，取出根，吸干，再放回原试管，各试管中加10ml，95%乙醇，封口，提取24h至根变白，根据颜色稀释35倍后，于485nm下比色。0.4%TTC：称TTC1g，溶于250ml水中。1/15mol/L，PH7.0的缓冲液：A61ml+B39ml，稀释至300ml1mol/L的H2SO4：先在烧杯中加约100ml水，再加浓硫酸11ml，冷却后定容至200ml。计算公式：四氮唑还原强度（g/gFW.h）=(OD+0.0035)/4*h*W*0.0022(h=4,W=0.40.5)10.叶绿素称取叶片0.2g，加20ml，80的丙酮（80ml丙酮定容至100ml），封口，置于暗处2436h，至叶片发白，于663nm、646nm、470nm下比色（以80丙酮为对照）。公式：色素浓度Ca（mg/L）12.21D663-2.81D646Cb20.13 D646-5.03 D663Cx.c（1000D470-3.27Ca-104Cb）/229色素含量（mg/gFW）C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)11硝酸还原酶（活体法测定）【样品应先照光23小时后采】称取叶片0.5g，剪成0.5-1.0cm2小块，加入试管中，对照先加1ml30三氯乙酸溶液，然后再向各试管中加入0.1mol/l KNO3溶液9ml，抽气1小时，置于25暗反应30min。然后向各试管中加入1ml30三氯乙酸溶液【待叶片变色后（黄）】吸上清液1ml于新试管中，加2ml 1的黄胺和2ml 0.02萘胺溶液。显色20min，540nm下比色。（吸光值不能大于2，否则应稀释再测）80个样的用量：0.1 mol/l，PH7.5的磷缓：A液420B液80水500，将KNO3 10.11 g溶于上述1000 ml磷缓中。1黄胺：称2.5克溶于62.5 ml浓HCL中，定容至250 ml。0.02N1萘乙二胺酸盐：称0.06克于300 ml水中。30三氯乙酸：称30克溶于100 ml水中。标准曲线：Y NO2 =8.7317OD-0.4178计算公式：NR 活性（NaNO2 ug/gFW.h）=Y .n/W. h ( n=10/2,h=0.5)12.自由水/束缚水含量测定取称量瓶n（每处理6个，3次重复）个，编号，分别称准重量，用0.5cm2左右的打孔器打取300片，分别随机放入称量瓶中（各50片），盖紧，准确称取各瓶重量，求出各瓶样品鲜重，将其中3瓶置烘箱中于105下10min杀死组织，再于80下烘至恒重，求出组织含水量（%）。将另外3个称量瓶各加入60%65%（重量百分浓度）蔗糖溶液5ml，再准确称量求出各瓶糖液重量，于暗处放置46 h，其间不时轻轻摇动。到预定时间后充分摇动，用折射仪分别测定各瓶糖液浓度，同时测定原来的糖液浓度。60%65%蔗糖溶液：6065g蔗糖，置烧杯中加蒸馏水4035g，使总重量为100g。计算公式：自由水含量（%）=100*(G*(D1D2)/D2)/W(G为糖含量g；D1糖液原来浓度%；D2浸叶后糖液浓度%；W植物组织鲜重g)束缚水含量（%）=组织含水量（%）自由水量（%）13.GR谷胱甘肽还原酶:（基于NADPH的氧化作用而在340nm下吸光度减少来衡量）鲜样0.5g，加入4ml50mmol/L的Tris-HCl（7.0），内含20（V/V）甘油，1mmol/LAsA，1mmol/LDTT，1mmol/LEDTA, 1mmol/LGSH及5mmol/LMgCl2，在冰上研磨后，提取液在4下，经过20000g离心30min，上清液用来测定酶活性。取上清液100L加入比色杯中（对照加100LTris-HCl），加3ml反应液，马上读340nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。反应液：50mmol/L的Tris-HCl（PH7.5），5mmol/LMgCl2，0.5mmol/LGSSG，0.2mmol/LNADPH，终体积为1.2ml计算公式：GR总活性(OD290min-1g-1FW)（OD340*V）/(a*W*t)(V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) GR比活力（OD340min-1g-1Pr）总活性/蛋白质浓度14.O2-超氧阴离子自由基：羟胺氧化法(王爱国等1990)称2g样品加3mL提取液研磨提取后,吸2mL提取液供测定,反应时间为20min,求每克鲜样每分钟产生O-2的速率.以上指标测定均重复3次.药品：磷酸缓冲液、Na2HPO42H2O、NaH2PO4H2O、Met、NBT、EDTA-Na2、FD、愈创木酚、30H2O2、TBA、NaOH、10三氯乙酸、考马斯亮兰、90的乙醇、85（w/v）磷酸、AsA、磺基水杨酸、冰乙酸、甲苯、茚三酮、蒽酮、乙酸乙酯、H2SO4、TTC、蔗糖、甘油、DTT、GSH、 MgCl2、Tris-HCl、GSSG、NADPH15. 可溶性糖：蒽酮比色法0.3g鲜样加1