细胞凋亡及其检测方法.doc

神经细胞培养第一节：细胞培养的基本知识1定义：组织培养 (Tissue culture ) ：细胞培养 (cell culture)：器官培养 ( organ culture)： 统称为体外培养 （In vitro)2 组织或细胞培养的优点：1）：研究对象是活细胞 2）：研究条件可以人为的控制3）：研究的样本可以达到比较均一性4）：研究的内容便于观察、检测和记录5）：研究的范围比较广泛6）：研究的费用相对比较经济7） ：可作为一些遗传物质的运载细胞8) ：干细胞的广泛应用前景3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类为3537；鸟类为38.5 b 气相及PH 值 ：O2及CO2的值： CO2=5%；PH=7.27.4 c 渗透压：260320m mol/L3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！ 无毒：与细胞直接接触者培养器皿、底物、培养基，蒸馏水等； 间接接触者配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染6 常用的培养用液及培养基 培养用液：水平衡盐溶液（）（见表）消化液胰蛋白酶液（）二乙烯四乙酸二钠（）胶原酶 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）合成培养基（ S F12（）等）常用的平衡盐溶液（g/L）Ringer(1985)PBSEargle(1948)Hanks(1949Dulbecco(1954)D-HanksNaClKCl900042800020680040800040800020800040CaCl2MgCl .6H2OMgSO4.7H2O0 250 200200 140201 10010Na2HPO4.H2O156006006Na2HPO4.2H2OKH2PO40201140062 42020006NaHCO3葡萄糖酚红3 201 000020 351 000020020 35002第 二节：神经细胞体外培养的 基本概念和方案 神经细胞培养的类型 1 神经细胞的原代培养 原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。 2神经细胞系培养细胞系的生长过程：有限细胞系：原代培养 传代期 衰退期无限细胞系：滞留期 指数增长期 平台期有限细胞系无限细胞系指数细胞数量培养时间（周）原代培养细胞系阶段二、常用试剂1） 培养液 A DMEM ： B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子2） D-Hank液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS）3) 聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min4) 神经营养因子： 睫状神经营养因子（ ciliary neurotrophic factor, CNTF): 支持交感神经、副交感神经和感觉神经的生长与存活； 脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor ,BDNF):支持外周和中枢特殊细胞群体的神经细胞； 硷性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF ) 等三、培养操作过程 新生13d SD大鼠，75%酒精浸泡约消毒，断头后移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中 剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37培养箱，定期振摇促消化。消化约20min， 用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次10min， 吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数， 用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成1106/ml细胞悬液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放置0.80.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37培养。四、神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白（Microtubule associated protein MAP2） 神经元,五、神经元的纯化：胞嘧啶阿拉伯糖 ，培养两至四天后用含510 m mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养24 hour ,然后改用常规培养液。 培养过程中注意事项 1） 培养底物的处理： 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸 细胞外基质成分（胶原） 细胞黏附分子 单层非神经细胞 单层的胶质细胞2） 胰蛋白酶的作用时间：3）细胞合适的换液时间：大脑皮质 不用经常换液 海马神经元应半量换液 胶质细胞经常换液六、神经元的观察： 刚分离出的神经元呈圆形，用倒置显微镜观察有明显的光晕。 接种一般在6小时可贴壁；8小时已有纤细有突起长出 24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为主 培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态多样，有些具有分枝的突起， 培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光滑的胞体，发育良好的突起。二、胶质细胞的培养胶质细胞 纤维性 的分类：a大胶质细胞 星形胶质细胞 原浆性 少突胶质细胞 b小胶质细胞周围神经系统主要是施万细胞胶质细胞的培养：特点：比较容易在体外培养生长，生长稳定，可以传代培养。贴壁过程慢，初期生长慢。传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。培养的方法： 1）取材 脑灰质或白质 2）洗涤 （Hanks液） 3） 移入试管吹打形成单细胞悬液 4） 静置10min 弃上层 5）过滤后收集细胞悬液，调整细胞密度104106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱培养 6）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可）传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁大部分 表面以前，不要急于传代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使细胞尽快适应新环境鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acid protein GFAP） 少突胶质细胞 鉴定：GalC（-galactosidase)神经肿瘤细胞系培养优点：有利于遗传学的研究缺点：不能表现出神经元分化的许多过程。神经细胞系的建立：1）动物诱发性神经肿瘤分离细胞进行培养2）将连续细胞系的细胞与神经系统特殊区域分离的细胞融合。3）利用含有癌基因的逆转录病毒感染神经细胞，使神经细胞获得永生。大鼠嗜铬细胞瘤株PC12的培养PC12细胞；来源于大鼠嗜铬细胞瘤克隆 ，其具有嗜铬细胞瘤和肾上腺嗜铬细胞相关的表型。可以合成儿茶酚氨，在有NGF的作用下细胞停止增殖，生长出神经突起等特点。一、 PC12细胞的常规培养1）培养液：85%RPMI1640培养液、10%马血清、5%胎牛血清，也可用DMEM或 F122）培养的底物：PC12细胞对塑料和玻璃似的黏附能力较差，所以必须在培养前进行底物处理：胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等PC12细胞的培养和传代1）PC12细胞 增倍时间为2.54天 实际可7-10天传代一次。2) 传代比例为1：3或1：43）换液时间为2-3天 每次换液约为2/3 的培养液4）通过机械分离进行传代培养-用吸管轻轻吹打5）必须选择生长在胶原底物的细胞群体进行传代PC12细胞的冻存和复苏PC12细胞可长期冻存保种过程： 细胞吹打从培养皿脱落，离心收集，并悬浮与10%DMSO的完全培养液中，用冻存管分装细胞悬液，放入-80C 过夜 达6个月。长期冻存可放置于液氮罐中。复苏：37 C 水浴中快速复温，离心漂洗去除冻存液后 重悬浮于完全培养液。PC12细胞培养常出现的问题1） 细胞生长不良2）细胞帖壁不良3）对 NGF 反应不良神经干细胞的分离和培养NSC可定义为既可以自我更新又可分化为中枢神经系统内所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；成年的SVZ 和海马齿壮回的颗粒细胞层成人嗅球神经干细胞培养骨髓基质细胞的转分化大鼠胚胎海马神经干细胞培养一、培养用液：PBS-G溶液：含有6g/L葡萄糖的PBS，ph=7.4 N2培养基：DMEM/F12（1：1）混合，添加有29mmol/l 孕酮 ，30 mol/l硒酸钠，100 mol/l腐胺，3.9 mmol/ 谷氨酰胺，5 g/ml 胰岛素， mol/l转铁蛋白。多聚鸟氨酸溶液：终浓度为 g/ml bFGF ,分装后 -20 C 终浓度为20ng/ml 二、细胞分离和培养步骤1）孕期16天大鼠 麻醉后腹部用75%酒精消毒，剪开腹腔 取出角状子宫，取出胎鼠。2）胎鼠用75%酒精消毒 断头处死，剪开颅腔，解剖显微镜下去除脑膜，分离获取海马组织。3）海马组织置于 PBS-G 溶液中 吹打40次 机械分离4） 离心吸除上清得到沉淀，用N2培养液重悬细胞5）取少量细胞悬液滴于血球计数板上 进行计数。6）将细胞接种于已经处理过的培养板上。7）培养液添加bFGF置37 C ，5% CO2 培养8）3-4天换液一次，培养一段时间传代神经干细胞培养的应用大大促进了神经发育机制的了解有效解决细胞来源问题，并使自体细胞移植治疗某些神经退行性疾病成为可能。基因治疗的载体神经干细胞的研究状况及意义：20世纪最后10年神经科学领域的重要进展之一就是发现在胚胎甚至成年脑组织内存在有神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs），它们在适当培养条件下可在体外呈神经球形式生长。Reynolds和 Weiss1在体外用表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGF）从脑组织中培养出神经球并发现其能分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞；将初次形成的神经球消化传代可形成二级神经球，它们同样具有多向分化潜能；说明EGF在体外可将NSCs维持在未分化状态并可促进其增加细胞数量。Johe 2和Gritti4则用碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）也同样从脑组织中获取到呈神经球形式生长的NSCs，也可以促进这种具有多向分化潜能的神经球在体外存活和增殖Shimazaki的实验证明白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）可将来自哺乳动物前脑的NSCs在体外培养条件下维持在未分化状态增殖3 。1Reynold BA, Weiss S . Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science , 1992 ,255:1707-1710. 2Johe KK, Hazel TG, MaKay RDG, et al . Single factors direct the differentiation of stem-like cells from foetal and adult nervous system. Genes Dev, 1996; 10: 3129-3140. 13Shimazaki T, shingo T, weiss S. The ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor complex operates in the maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci, 2001; 21(19): 7642-53. 4Gritti A, Parati EA, Cova L, et al. Multipotential stem cells from the mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J neurosci, 1996; 16(3): 1091-1100.细胞凋亡及其检测方法l 1885年 Flemming退行性卵泡上皮细胞的染色质聚集成半月状或固缩成小体状；l 1886年 Nissen在哺乳期乳腺中观察到类似改变；研究细胞凋亡的意义l 有助于理解健康与疾病、生命与死亡 ；l 有助于理解一些病毒和细菌侵袭人体细胞的机理 ；（神经变性性疾病、中风、心肌梗塞和自身免疫疾病 ）l 有助于疾病的防治激活或抑制细胞“自杀程序” ； 控制细胞凋亡的信号通道的正常与异常机理 王晓东教授主要研究成果集中在对于哺乳动物细胞凋亡的生化调控机制和信号通路的研究。2004年4 月21 日当选为美国科学院最年轻的院士。 教学目的1、掌握细胞凋亡的特征。2、通过对细胞凋亡检测方法的学习，能结合本专业完成研究细胞凋亡的实验设计。细胞凋亡的定义l 细胞凋亡(Apoptosis)是指在一定生理或病理条件下，遵循自身的程序，启动一系列死亡基因的表达，引起内源性核酸内切酶和蛋白裂解酶的合成，导致DNA裂解乃至细胞的主动死亡。l 细胞程序性死亡（Programmed Cell Death PCD）细胞凋亡的诱因 1细胞凋亡的抑制因素细胞凋亡的特征性变化形态学 (续)形态学变化l 胞质的变化u 胞质浓缩（70%）u 细胞器的变化 线粒体（变化不明显；个别线粒体增大、增殖、空泡化） 内质网（网腔扩大、提供包裹膜） 细胞骨架（肌球蛋白、肌凝蛋白表达下调）l 细胞膜的变化u Zeiosis（泡化）u 生物大分子丢失u 新出现生物大分子（phosphatidyl serine）l 凋亡小体的形成（Apoptosis Body）u 凋亡过程中，核膜逐渐曲折变形、核仁裂解，随后胞膜内陷，整个细胞被分割为数个大小不等的有膜包裹的、内涵物不外泻的不连续小体，其内部可有一部分细胞器及核，该小体叫做凋亡小体。细胞凋亡的特征性变化生物化学（一）DNA Ladderl 最突出的生化改变是染色质DNA的有控裂解。细胞发生凋亡时，细胞核内DNase、DNase在核小体间将染色质切为180-200bp或其整数倍的寡核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳分离裂解后的DNA图谱呈梯状，即梯状DNA。细胞坏死时DNA 随意裂解为长度不一的片断，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状(smear)”.细胞凋亡的特征性变化生物化学（二）多种蛋白酶的产生u caspase蛋白酶 （特异性酶切天冬氨酸氨基位点的半胱氨酸蛋白酶 Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase） 均以休眠状态的酶原形式存在于正常细胞中; 都具有相似的催化部位，包括一个含有活性位点Cys残基的保守的QACRG基元和一个含His残基的SHG基元; 具有自身活化和/或相互激活的能力;u 粒酶（granzyme）-免疫细胞释放的丝氨酸蛋白酶u Calpain;细胞凋亡的特征性变化生物化学l （三）胞浆Ca2+的变化 1、胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流促使胞浆Ca2+持续升高以信号转导方式、激活蛋白酶方式、激活核酸内切酶方式、激活转谷氨酰胺酶（transglutaminase）方式启动细胞凋亡； 2、Ca2+的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分与细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。 l （四）胞浆pH值的变化 1、胞浆酸化主要通过激活酸性DNase启动细胞凋亡； 2、pHi降低也增强了一些酸性蛋白质功能，如转谷氨酰胺酶、酸性鞘磷脂酶； 3、减弱细胞的呼吸爆发作用，生成与细胞凋亡相关的活性氧（reactive oxygen species,ROS）。 4、胞浆碱化可激活碱性核酸内切酶启动细胞凋亡。 细胞凋亡时线粒体的变化1、细胞凋亡时，线粒体呼吸链受损，使细胞 生成ATP减少，导致细胞死亡；2、线粒体产生的ROS增多，促进了细胞凋亡；3、线粒体膜电位受损影响其功能，导致细胞 凋亡；4、线粒体渗透性转换孔（mtPTP）开放。细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡的基本过程 信号始动阶段：细胞膜表面特定受体可识别细胞死亡的胞外信号并激活第二信使、激酶，始动凋亡； 凋亡信号的传导：P53、FADD、TRADD等介导凋亡信号的传导； 调控阶段：由Bcl-2蛋白家族、细胞色素C及Caspase蛋白酶三个效应器参与调控； 细胞凋亡的执行阶段：细胞结构发生改变，呈现细胞凋亡形态学变化。细胞凋亡信号转导分子1、Fas/FasL系统，TNF/ TNFR系统；2、 FADD（Fas-associating protein with death domain）， TRADD （TNFR1-associated death domain protein）； 3、 Bcl-2蛋白家族；4、细胞色素C及Caspase蛋白酶；5、 P53Bcl-2家族Bcl-2抑制凋亡的可能机制l 抑制细胞质膜脂质过氧化物的形成，从而阻止氧化应激导致的细胞凋亡。l 调节线粒体通透性。降低由凋亡因子诱导的线粒体膜通透性的增加；l 增加线粒体摄取Ca2+的作用，提高线粒体对Ca2+诱导呼吸链损伤的耐受力。l 抑制线粒体释放细胞色素C。l 抑制Caspase-3蛋白酶的活化。神经细胞凋亡的研究模型 1、从胚胎发育第21天大鼠分离获得交感神经元， 在外与NGF持续共同培养7d，然后加入抗NGF抗 体，封闭NGF；2、去神经营养因子诱导神经细胞凋亡 ；3、去血清诱导细胞凋亡；4、低氧神经元凋亡模型；5、低钾神经元凋亡模型;6、各种凋亡诱导剂诱导的体内凋亡模型；7、副交感神经元、运动神经元去轴突凋亡模型。神经细胞凋亡的检测方法 l 根据凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征进行检测以及利用流式细胞仪进行检测。形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法，主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色。 研究方法的分类一、根据方法的定性和定量特性分类(一)只能定性的方法 常规琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）。(二)能进行定量或半定量的方法 各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA、定量琼脂糖凝胶电泳。（续）研究方法的选择二、根据是否能将凋亡和坏死区分开1、不能将凋亡和坏死区分开 原位末端标记法，PI单染色法 等。2、将凋亡和坏死区分开 琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（特别是透射电镜是区别凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，Annexin V/PI双染色法流式细胞仪检测等。 （续）研究方法的选择三、根据样本来源不同选用不同的方法1、组织 对活检组织或手术标本主要用形态学的 方法如HE染色，透射电镜，还可以进行石蜡 包埋组织切片行原位末端标记。也可作ELISA 和将组织碾碎消化作琼脂糖凝胶电泳。2、培养细胞 对细胞株或原代培养的细胞几乎所 有的方法都可用。细胞凋亡的检测方法l 普通光学显微镜观察方法 l 透射电子显微镜观察方法 l 荧光显微镜观察方法 l 琼脂糖凝胶电泳 l 原位末端标记技术 l 流式细胞仪染色法l 早期：核染色体发生边集、固缩，电子密度增强，核形不规整，核膜表面凹凸不平；l 核发生碎裂，在细胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片；细胞体积变小，胞浆浓缩，空泡增多；l 晚期：可见膜包裹的内有较完整的细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。 常规琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladderl 检测细胞凋亡时染色体从核小体间裂断形成由大约为 180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。提取DNA片段，UV灯下观察可见特征性的“梯状(ladder)”带。l 缺点:敏感性不高，且不能定量 常规步骤l 收集细胞，PBS漂洗1次，2000r/min离心5min，弃上清。l 在1.5ml微量离心管中，离心收集细胞，弃上清。l 加入TE缓冲液400l，悬浮细胞；缓漫加入1%SDS溶液20l，摇匀。l 加入RNase(200g/ml)42l混匀，终浓度为20ug/ml，37，60min。l 加蛋白酶K溶液21l至终浓度为100g/ml，混匀，于50温育3h。l 冷却至室温，然后加入等体积的饱和酚抽提DNA，混匀后10,000r/min离心10min。l 吸取上清至另一EP管，加1/2体积氯仿：异戊醇抽提，混匀后10,000r/min离心10min。l 取上清至另一EP管，加等体积氯仿：异戊醇再抽提一次，10,000r/min离心10min.l 取上清至另一EP管，加1/10体积的5mol/L乙酸钾和2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，可见絮状白色沉淀物，置于-20沉淀过夜。l 12,000r/min离心10min沉淀DNA，弃上清，加1ml 75%乙醇洗沉淀的DNA，12,000r/min离心10min，充去上清液。l 置室温待乙醇挥发尽之后，加20lTE缓冲液轻轻摇动溶解。l 取20l样本，加4l上样缓冲液，立即加到含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶的样品孔中，于1TAE缓冲液中电泳(电压60V)1.5-2h，紫外透照仪下观察结果，拍照存档。琼脂糖凝胶电泳的定量检测 l 将放射性同位素32P标记在经提取的寡小体片段5末端，用X光片通过放射自显影成象，并用特定的设备分析计算进行定量研究。l 优点:灵敏度极高，是常规琼脂糖凝胶电泳的1000-2000倍；能定量； 常规步骤l (1)DNA提取同常规琼脂糖凝胶电泳法。l (2)在0.5ml Eppondorf管中加入下列反应体系：l 细胞DNA0.5-1.0gl 10缓冲液2ll 32P-dATP（或32P-dCTP）0.5Cil Klenow聚合酶5Ul 双蒸水加至20ll (3)混匀后10000r/min离心数秒，置室温中反应30min。l (4)加入1l 0.5mol/L EDTA终止反应。l (5)常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，室温干燥。l (6)加入20l TE缓冲液溶解DNA。l (7)取标记DNA20l加上样缓冲液4l，混匀后加样于1.8%琼脂糖凝胶，50V 电泳约2h。l (8)电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进地放射自显影。 原位末端标记技术 l 原位末端标记(in situ end-labeling, ISEL) 是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。l 催化酶 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) DNA聚合酶I常用原位末端标记技术l 1.末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling)，简称TUNEL；l 2.DNA聚合酶I介导的原位缺口平移(in situ nick translation)简称ISNT。常用的标记物和显示系统l 生物素标记的dUTP(biotin-dUTP)，其相应的显示系统为卵白素（avidin）或链卵白素(streptavidin)标记的辣根过氧化物酶（HRP）和显色底物DAB；l 地高辛(digoxigenin)标记的dUTP(digoxigenin-dUTP)，显示系统为辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(正常羊Fab片段)和DAB；l 荧光素标记的dUTP（常用FITC-dUTP）,用流式细胞仪分析或在荧光显微镜下观察。 神经细胞凋亡的检测方法-ISNT l 基本原理细胞凋亡时产生DNA断链，利用DNA聚合酶 I 5-3聚合酶活性，可将外源掺入的带有生物素标记的游离核苷酸从3羟基末端起始经5-3方向连接在断端上，根据其携带的标志物选择适当的显色系统，观察细胞是否存在有核苷酸掺入的DNA断端。ISNT结果判断l 采用Biotin-16-dUTP对石蜡组织切片凋亡细胞内DNA断裂片段的末端进行标记，凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致。而正常非凋亡细胞和阴性对照片核被苏木素复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一致。 神经细胞凋亡的检测方法-TUNEL l TUNEL所介导的酶是TdT，该酶能将外源性的生物素或地高辛标记的dUTP无需DNA模板连接到凋亡细胞核DNA断链的3-羟基(3-OH)末端，根据dUTP携带的标志物选择适当的显色系统原位显示DNA断端。 在目前常用试剂盒中，多用TdT酶催化DNA单链和双链3-OH末端非模板依赖性的Br-dUTP掺入反应。用荧光标记的BrdU抗体进行细胞染色后，用流式细胞仪来检测，即可得到细胞凋亡结果。 与其他标记物相比（荧光素、生物素或地高辛）， Br-dUTP更容易掺入凋亡细胞的基因组中。原位末端标记技术注意事项 l 对组织切片进行预处理是必要的，可以提高该方法的敏感性和消除假阳性及非特异性染色。预处理主要包括： 组织切片用2SSC加热，80共孵育20min； 内源酶阻断剂可消除由内源性过氧物酶引起的非特异性染色； 蛋白酶的消化，时间要得当； TdT 及DNA多聚酶I的浓度过高也可引起非特异性染色。 流式细胞仪FLOW CYTOMETERl用流式细胞仪(flow cytometer)检测细胞时，必须用荧光染料对细胞进行染色，并要求细胞呈悬浮状态。l可将细胞分类作进一步的形态学和生化分析。l既可定性又可定量，且具有简单、快速和敏感性高等优点。 散射光信号l FS-Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 ;l FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性,如:大小l SS-Side (Angel Light) Scatter -与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器;l SS用于检测细胞内部结构, 如:胞浆内颗粒多少, 核质比 .流式细胞仪检测凋亡细胞的原理一、核的改变;二、细胞膜的改变通透性增加； “活(viable)”细胞在不经固定的情况下对EB、PI或7-AAD等染料拒染； 三、光散射特性四、线粒体跨膜电位五、溶酶体质子泵六、蛋白质和DNA含量 常用荧光染料的特性用于流式细胞仪检测的荧光染料Annexin V 检测细胞凋亡l Annexin V是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。l 因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。凋亡细胞的TUNEL流式细胞仪分析l 固定细胞的染色方法 TUNEL在显色时用FITC标记链卵白素与Biotin结合，再结合PI染色就可以通过流式细胞仪检测凋亡细胞，这种方法不仅可以定量检测凋亡细胞，而且还可以显示凋亡细胞在细胞周期中所处的位置(G0/G1)。常规步骤l 1.离心收集细胞，PBS洗1或2次；1%多聚甲醛(PBS配制pH7.4)低温下固定15min；l 2.3ml PBS洗1次，70%乙醇固定，-20放置1-3d；l 3.PBS轻洗1次；细胞与50-100l的TdT标记液（含Biotin-dUTP ）37孵育，时间1-2h；l 4.PBS轻洗1次；细胞在黑暗中37与100l的染色缓冲液（含 Avidin-FITC ）孵育30min；l 5.含0.1% Triton-X 100的PBS轻洗1次；l 6.1ml PBS(含5mg/ml PI, 0.1% Rnase A)重悬；l 7.流式细胞仪分析红色(PI)(取线性值)对绿色荧光(FITC)(取对数值)的地形图。l 结果判断： 1. 凋亡细胞与正常细胞相比，FITC染色明显增强； 2. PI染色反应用于指示细胞周期，对于有细胞周期特异性的apoptosis,可在地形图上相应的细胞周期（ PI染色反应）位置上方出现一群FITC的细胞群。优 点l -dUTP是被直接结合在DNA断链3-OH末端，因此检测是在分子水平；l 可以在凋亡的早期阶段细胞还没有出现形态学改变时检测出细胞凋亡；l 样品在乙醇中固定保存较长时间而不会影响检测效果，因此很适合于临床标本的检测。非固定细胞的染色方法l Hoechst 33324/PI双染色法 正常细胞为低蓝光/低红光(heochst33342+/PI+)，凋亡细胞为高蓝光/低红光(Heochst 33342+/PI+)，坏死细胞为高或低蓝光/高红光(Heochst33342+或+/PI+)；l Annexin V/PI双染色法 正常细胞为低蓝光/低红光(heochst33342+/PI+)；凋亡细胞为高蓝光/低红光(Heochst 33342+/PI+)；坏死细胞为高蓝光/高红光(Heochst33342+/PI+) 。细胞凋亡调控基因表达产物的FCM检测? Apo 27? bcl-2? P53? Fas及FasL? Caspase(半胱氨酸蛋白酶)思考题1、名词解释：细胞凋亡； 凋亡小体2、细胞凋亡的形态学、生化学有哪些改变？与 坏死有哪些区别？3、 Annexin V 检测早期细胞凋亡的原理。4、原位末端标记技术检测细胞凋亡的原理。Assays of the Cardinal Neurotransmitters in the Brain (Microdialysis&HPLC)(脑内神经递质及检测技术)Chun-li, Duan(段 春 礼)Definition A substance that is released at a synase by one neuron and that affects a postsynaptic cell, either a neuron or effector organ in a specific manner. An important characteristic of neurotransmitters is that their effects are transient, lasting from milliseconds to minutes. Nevertheless, neurotransmitter action can result in long-term changes in target cells lasting hours or days.Criteria It is synthesized in the neuron. It is present in the presynaptic terminal and is released in amounts sufficient to exert a defined action on the postsynaptic neuron or effector organ. When administered exogenously( as a drug) in reasonable concentrations, it mimics the action of the endogenously released transmitter exactly ( for example, it activates the same ion channels or sencond-messenger pathway in the postsynaptic cell). A specific mechanism exists for removing it from its site of action(the synaptic cleft).The Cardinal Neurotransmitters in the Brain Acetylcholine Biogenic Amine Transmitters including catecholamines(dopamine-DA, norepinephrine-NE, and epinephrine-E) and indoleamines(serotonin-5-HT). Amino Acid Transmitters glutamic acid(Glu), aspartic acid(Asp), glycine(Gly), -aminobutyric acid(GABA) Histamine Purinergic transmitters ATP and AdenosineTHE ACETYLCHOLINE SYSTEMS THE BASAL FOREBRAIN SYSTEM THE PONTINE AROUSAL/REM SYSTEM INTERNEURONS IN THE BASAL GANGLIAlocated in the medial septum, vertical and horizontal limbs of the diagonal band of Broca, and the nucleus basalis Cholinergic neurons in the medial septum/vertical limb project primarily to the hippocampus The axon terminals of cholinergic neurons found in the horizontal limb and nucleus basalis are directed primarily towards the neocortexImportant for arousal and memoryDestroyed in Alzheimers disease arises from the brainstem (found in the laterodorsal and pedunculopontine tegmental nuclei) to the midbrain and thalamus (primarily innervate the thalamus) related to sleep-wake rhythms and turning on REM acts as a sensory filter in some way It has been shown that schizophrenics has a less CAT(choline acetyltransferase) in the pontine cholinergic nucleus.THE DOPAMINE SYSTEMSTHERE ARE 4 SYSTEMS OF PHARMACOLOGICAL INTEREST:The most important is the forebrain dopamine system, which has two subdivisions: 1. The nigrostriatal system 2. The mesolimbic systemTwo much more limited systems are: 3. The tuberoinfundibular system 4. The medullary vomiting systemTHE NIGROSTRIATAL DOPAMINE SYSTEM Cells of origin: located in the ventral mesencephalon in a half-moon shaped nucleus called the SUBSTANTIA NIGRA Project to: the striatum, that is the caudate nucleus and related parts of the basal ganglia Function: poorly understood called the EXTRAPYRAMIDAL MOTOR SYSTEM because damage here caused odd movement disorders, including Parkinsons. a part of the