亚硫酸盐还原菌酶活翻译.doc

沙门氏菌 typhimurium 的 cysJIH 区域的描述而且大肠杆菌 B为 SIROHEMEFe4 S4 有效中心的 cysl 及 cysH 及 A 模型的去氧核醣核酸序列，用菠菜基于胺基酸同系现象的 REDUCTASE 血红素蛋白REDUCTASE（为出版收到， 1989 年三月 15 日)亚硫酸盐亚硝酸盐Jacek Ostrowski, JerYuarn 的 Wu5 ll，大卫 C. RuegerllII，巴尼 E. 米勒*, 路易斯 M. Siegel ll,而且尼古拉斯 M. Kredich 5从霍华德修医疗的学会实验室和部门 生物化学和 医学，公爵大学医疗中心、达拉姆、北卡罗莱那州 27710 和 TBasic 科学区分，退伍军人政府医疗中心，达拉姆，北卡罗莱那州 27705沙门氏菌 typhimurium 的血红素蛋白成分亚硫酸盐 reductase（还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸）(EC 1.8.1.2) 是cysJ 266 的被净化的 toh omogeneity 一，突变异种紧张缺乏的亚硫酸盐 reductase 黄素蛋白。sirohemeandFe4 S4-containinge 的 nzyme 被隔离了当做一单节显性的63 kDa 的多月太而且有了一个混合不结扎的酶和一个合成物以亚硫酸盐。下列各项还原反应与 5deazaflavinEDTAa 的 nd 再化氧化作用，合成物被转换到这不合成物，高度地快速旋转含铁siroheme 的州 seenp reviously藉由大肠杆菌亚硫酸盐 reductase 血红素蛋白准备。S。typhimurium 血红素蛋白展现接触反应的和物理性质相同这被大肠杆菌的尿素分解准备的血红素蛋白亚硫酸盐 reductase 全濥而且完全能干在再构成还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸亚硫酸盐的 reductase 活性方面当以被净化亚硫酸盐 reductase 的过度联合黄素蛋白。cysl 和 cysfHro m S 的去氧核醣核酸序列。typhimurium而且大肠杆菌 B 被决定了和，一起与先前报告数据，确认组织这一个区域当做促进剂cysJcysIcysH 与所有三个基因在相同的方向定向从这促进剂。分子的压重为 CYSIencoded 推论亚硫酸盐 reductase 血红素蛋白和为这cysH改为暗码 3- phosphoadenosine 5-phosphosulfatesulfotransferase 大约 64,000 和28,000, 分别地。比较这推论亚硫酸盐 reductase 血红素蛋白的胺基酸序列藉由 thato f 菠菜亚硝酸盐 reductase （BacEk，.， Burkhart，W。， Moyer，M。， Privalle，L。，而且 Rothstein，S。（1988) 摩尔。麝猫科将军。212,20-26), 哪一个也包含siroheme 和 Fe4 S4 群，表示二群体包含半胱胺酸的序列与这s t ructures C顺式 (X）-acnyds Cys(X）&ys，是相应的在这两个酶中而且被要求到这一个工作被国家卫生局授与支援了DK 12828(对 N. M. K.）、 GM 32210 和 GM21226(对 L. M. S.）, 和在退伍军人政府计画授与 215406554-01 手边 (对 L. M.S)。这一个制品的出版的费用部份地被支付被页的付款要价。这一个制品一定因此是藉此显着的 广告 符合 18 U.S.C.第 1734 节独自地标示这一种事实。这纸专心致志于亨利教授 Kamin 的记忆，谁的初期工作在 siroheme 上酶亚硫酸盐 reductase而且亚硝酸盐 reductase 让这些研究可能。11现在的住址：有创造力的生命分子、波士顿，文学硕士。现在的住址：Abbott 实验室，Abbott 公园 IL。到谁通信应该被演说。在两者蛋白质中提供 Fe4 S4 群的配位体。从 crystallographic 的这些 sequencesa nd（McRee 、 D. E. 、理查森、 D. C. 、理查森， J. S.，而且 Siegel，L. M.（1986) J. Biol。Chem。261, 10277-10281)而且在文学中的分光镜的数据，一模型为 structuroef 被计划有效中心这些两个酶。沙门氏菌 typhimurium 和 Escherichia 的 cysJIH operonscoli 入码活性必需的为两步舞还原反应3- phosphoadenosine 5 对硫化物的 phosphosulfate. （1)3- Phosphoadenosine 5-phosphosulfate sulfotransferase，藉着 cysH 指定，c atalyzes transfero f 硫醯分子的某部分3- phosphoadenosine 5-phosphosulfate 对硫氧还蛋白到给硫氧还蛋白顺式的 SOg后来的衍生物 （2,3)减少给自由的亚硫酸盐。亚硫酸盐然后接受一六电子的还原反应对反应的硫化物催化被亚硫酸盐 reductase（还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸）(EC 1.8.1.2), 一个复杂的酶两个不同缩氨酸，以原体组成结构一.(4,5)subbnit 是一个黄素蛋白 （爵士FP）, 哪一个被编码为藉着 cysJ 而且包含两者 FMN aFnAdD 。这3原体是一个被编码的血红素蛋白 （爵士HP）被cysl 而且包含 Fe4 S4 群和 siroheme 的一个分子（6,7).遗传基因、生物化学的研究标示那在 S 的 cysJIH。typhimurium 是一抄写组件与级：促进剂cysJcyslcysH. （8-11)一个不同的组织cysJIH 区域已经为大肠杆菌被计划K-12, 哪里 cysl 和 cysJ constitutae 抄写组件与级促进剂cyslcys和 cysH 被表达从一分开促进剂. （12)在两者 S 中。typhimurium 和大肠杆菌这些基因是半胱胺酸 regulon（13) 的一部份而且是肯定地根据 cysB 蛋白质管理和被任一 0-乙醯基L丝胺酸 （14-16) 或正- 乙醯基L丝胺酸 （ll）,w hich 行为当做共同 inducers。cysJIH 促进剂的一个详细分析S。typhimurium 和大肠杆菌 B 已经被报告 （ l l ） , 当做涌出当做这些细菌的 cysJ 的描述和S 的改为暗码 cysJ 爵士FP 的物理化学研究。typhimurium。被用的缩写是：爵士FP，亚硫酸盐 reductase 黄素蛋白；爵士，还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸亚硫酸盐 reductase；爵士HP，亚硫酸盐 reductase 血红素蛋白；MVH ，减少 methylviologen；SDS页，聚丙烯醯胺在钠十二烷基硫酸酯中的凝胶电泳；ORF ，打开阅读框架；kb， kilobase 双 （s）;REP，重复的 extragenicpalindromic；HPLC，高成形液体色谱法。Ostrowski，J。，理发师、 M. J. 、 Rueger 、 D. C. 、米勒、 B. E. ， Siegel，L. M. 和 Kredich，N. M.（1989) J. Biol。Chem。264, 在杂志报纸中。15726cysJIH 描述和亚硫酸盐 Reductase 血红素蛋白 15727在早先的研究中在这之上物理化学、接触反应的爵士的性质HP， thefr ee 血红素蛋白已经被获得4 或 5 只有藉着大肠杆菌 B 爵士全濥的分解M 尿素. （5)决定如此的准备是否可能有被 urfea 治疗改变，我们已经隔离爵士HP直接地从 S。typhimurium cysJ 266, 突变异种紧张哪一不能够制造全濥的爵士FP 成分。Siegel 等人 （18) 先前发现那爵士全从大肠杆菌 B 和 S。typhimurium 几乎同一被分光镜、接触反应、和免疫化学的标准，和结果在这里报告标示爵士HP 净化从 S。typhimurium cysJ 266 对那事实上同一从大肠杆菌 B 爵士全濥的尿素治疗获得。在加成，我们在这里报告 cysZH 的去氧核醣核酸序列S 的区域。typhimurium 和大肠杆菌 B 和礼物描述cysJIH 的全部组织，开着的阅读框架对 cysZ 和 cysH 符合，和比较被推论的爵士HP 的胺基酸序列改为暗码被cysZ 与为菠菜 ferredoxin 根据背等人 （19) 报告亚硝酸盐 reductase（EC 1.7.7.1).这一个比较，一起藉由 crystallographic 和分光镜的数据在这文学为大肠杆菌爵士HP 和菠菜亚硝酸盐 reductase，已经领导我们为活性部位结构计画一个模型这些酶。实验的程序材料爵士FP 从 S 被净化。typhimurium cysG 439 被Ostrowfki et 的程序一 1.黄素蛋白的浓度坚决的 spectrophotometrically 正在使用 c 456=10.9(毫莫耳黄素） cm1.2 爵士HP 被大肠杆菌的尿素分解准备了如 Siegel 和戴维斯所描述的 B 爵士全濥. （5)链霉素硫酸酯来自于希腊文的第十八个字母， Pharmacia 的塞法戴克斯 G-150(过细的）LKB 生物科技公司、和 DE-52 microgranular 二乙胺基乙基纤维素来自于华特曼纸。5 水溶液-deazaflavin，一有雅量的大卫 Seibrert 博士的礼物，是被准备而且定量的 spectrophotometrically如 Massey 和 Hemmerich 所描述（20).细菌的紧张、媒体和质体细菌的紧张用在第一桌子被描述。（8,21-25)最小的媒体是萣生熟的 E（26) 除了 maxicell 实验以外以 0个 5% 葡萄糖补充哪里 M9 介质 . （27)藉由 0.5% 葡萄糖和 1% casamino 酸被用了。（24)富有的媒体为质体变形有了磅而且为 M13 抗菌素生产的 YT. （27)固体媒体包含了 1.5% 琼脂，青霉素在 25 毫克升被增加了当适当的为选择AmpR 劳累。cysJZH 藉由为 Cys 选择从染色体去氧核醣核酸被复制TABLEI细菌的紧张大肠杆菌”BJA199EC1124CSR603 bcysG 439cysH 75cysZ 68c.ysJ 266S。typhimurium野性的类型 ATCC 11303AtrpE。5 罗马尼亚的货币单位6 thi hsdR hsdM J. 碳AtrpE。5 罗马尼亚的货币单位6 thi hsdR hsdM从 JA199 被第一 cys A. WiaterrecAl t 1 urA 6 phr1(23,241cysG 43.9cysH 75cysZ 68cysJ 266cysJZH 383 AcysJZFf383（22)LB5000 d metA 22!量 551 trpD 2个罗马尼亚的货币单位（25)hsdLT hsdSA hsdSB一个大肠杆菌衍生物是除了野性的类型大肠杆菌 B 以外的 K-12 衍生物。除了那些 rele 之外， CSR603 有多个基因标记S。typhimurium 紧张除了 hisG 70 以外是 LT2 衍生物,LB5000 是所有的三 S 的 mf 。typhimurium 修正制度。为 maxicells 的生产的对它的使用的 vant。LT7 是紧张。大肠杆菌 cysZ EC1124 的转化株.pGBK 5(图 1) 包含一 13.0-kb Sal1 S 的碎片。typhimurium LT7 紧张 hisG 70 插入进入 pBR 322 之内.(11)pJYW 2(图 1) 包含一个 9.5 kb 的大肠杆菌 B 碎片获得从一本被插入的部分的 Sau3 A 文摘到这BamHI pBR 322 的位置.质体 pGBK 11 、 pJOK 20 ， pJOK 21,pJOK 22, 和 pJOK 23 包含 portionso f pGBK 5个插入物而且是在下面描述。进入 S 之内的下列介绍。typhimurium LB5000被变形，质体被转移到 othSer 。typhimurium抗菌素 p 的紧张斡旋 22HT 的转换. （28)测定还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸依赖的还原反应反应是在包含 0.05个 M 磷酸钾的 1.0 毫升体积中测量，酸碱值 7.7, 0.1 毫莫耳 Na 、乙二胺四醋酸、 0.2 毫莫耳还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸， 0.1 p FMN，一充用酶的数量、和 0.5 毫莫耳亚硫酸盐或 10 毫莫耳当做一个电子受体的羟胺。cysJ 266 的爵士HP 是在 4 点在化验之前抱 5 分钟 C 用 30个毫微莫耳（在黄素中）爵士FP 为了要再构成还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸爵士的全濥。这反应被酶，和减少的加成开始了在一 340在 25 被测量 C 在卡里模型 14 分光光度计中反对一个包含所有反应成分的叁考溶液除这电子受体。计算为 6.22 还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸使用了 EM毫莫耳 cm.MVH亚硫酸盐的 reductase 活性厌氧地被化验如 Krueger 和 Siegel 所描述. （29)反应率被决定了在 600个 nm 的 spectrophotometrically13 毫莫耳 假定 ccm”为 MVH 化氧化作用. （30)一单位活性被定义为那酶的数量催化任一 1 pmol 的化氧化作用在 standarda 下面的还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸或 MVH最小的 2 pmol ssay 情况。爵士HPS 的洗净。typhimurium cysJ 266 缺乏能力合成爵士全濥的爵士FP 成分而且是一爵士FP 完全自由的爵士HP 的方便来源。细菌被连续的文化与精力充沛充气作用成长了在一个 30-升发酵连接到在萣生熟的 E 中的一个 CEPA 离心机（26) 以 0.5% 葡萄糖和 0.15个毫莫耳 Ldjenkolic 酸补充当做一个限制的硫来源。在 5-10 X 10 毫升 的密度的电池是在 8-9 的比率升h 收割了，当新鲜的介质被增加了的时候在相同的比率。在新鲜介质的 105个升的加成之后这使被抽干发酵，和电池浆糊在 -15 被储存了 C直到进一步的使用。大约 1 克湿气重量每一升被获得介质。标示。爵士HP 被它的能力化验了催化 NADPHThe整个的洗净在 0-5 点被运行了 C 除非另外羟胺的依赖还原反应当着爵士FP 面前从 S 净化。typhimurium。这一个化验是三次当做敏感的当做还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸亚硫酸盐的 reductase 化验而且特别有用对天然萃取物的化验。di Jeso（31) 的反应式习惯于在 0 点计算百分比硫酸铵溶液的饱和 C。对于准备在表 11 概述, 130 克冷冻电池在前一夜 4 点被融解 C，中止的在 2 册标准方面缓冲液 （0.05个 M 磷酸钾， 0.1 毫莫耳 Na2 乙二胺四醋酸，酸碱值 7.7), 和150 毫升部分在温度被音波的振动打乱了维护在 5 和 15之间 C 藉着被包含在的一个 Rosett 电池的使用一个冰的浴。电池和瓦砾堆的下列移动藉着离心分离60 分钟在 48,000 X g，浮在表面的部份 （天然的萃取物）是被 0.5 册一个链霉素硫酸酯的寒冷 10% 溶液混合的那被在标准的缓冲液中溶解而且与 5 N 一起被使中立KOH。这混合为 30 分钟被激起了而且离心分离机在 23,000为 90 分钟的 X g。链霉素硫酸酯上澄清液被带给了在硫酸铵中，和在 60 分钟之后的 32% 饱和活泼的使蛋白质的陷入在 23,000 X g 被离心分离移动了30 分钟。上澄清液被升起到在铵中的 52% 饱和了图 1.质体携带 S 的 cysJIH 区域。typhimurium而且大肠杆菌 B. 两者都是 pBR 322个衍生物。pGBK 5包含 S 的一个 13.0 kb 的插入物。typhimurium LT7 紧张 hisG 70,而且 pJYW 2 包含大肠杆菌 B. 符号的一个 9.5 kb 的插入物；我，插入物分配；n，po 被序列了的插入物的 rtions。15728 的 cysJIH 描述和亚硫酸盐 Reductase 血红素蛋白TABLEI1S 的洗净爵士HP 的摘要。typhimurium cysJ 266步骤 VoSlupmecei fic TTotoatla l活性 upnroittse”i n毫升毫克 unitsjmg ？恢复天然的 extractb 32013,9001500.011(100)链霉素上澄清液 43014093硫酸铵部份 162786,1000.01610043F1 ir。5 多岁 9 t DEAEce 的 llulose poo 6 l 53.0412.3同意 4 ra 。1 te d 塞法戴克斯 G-150 告发 4419290.9第二个 D1E。0个一个电子纤维素告发 252817”爵士FPdeDendent 的还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸hvdroxvlamine 的 reductase 活性。我从冷冻电池中的 130。硫酸盐化，在 60 分钟之后，沈淀被离心分离收集了而且在 0.01个 M 磷酸钾，酸碱值 7.7 中溶解了, 包含0.1 毫莫耳 NazEDTA。这溶液广泛地被透析了反对这相同的缓冲液。被透析的硫酸铵部份被应用到这 56 X 2.5 了-DE52 的 cm 柱以透析缓冲液平衡，和柱与相同的缓冲液的 1个升一起洗。当时的蛋白质被洗提了在 40 的流率毫升h 以一个 3 升的线性 0.01-0.035 倾斜度M 磷酸钾，酸碱值 7.7, 包含 0.1 毫莫耳乙二胺四醋酸，和 20-毫升部份为蛋白质和濥的活性被化验。SiRHP在磷酸盐大约 0.023 M 的浓度被洗提。部分的特定的活性 1.0 单位毫克或比较棒的被告发了和以一个 Amicon 下午 -30 膜集中了至超滤的 7 毫升然后至 3 毫升以 Schleicher Schuell 胶棉袋仪器。这材料，指定了第一个二乙胺基乙基纤维素池，在硫酸铵中的被包含的 65% 的濥的活性部份而且提供特定的活性99 折层的增加。跟随这对 50 的浓度的蔗糖的加成毫克毫升酶溶液更进一步被分别被凝胶凝胶色层分析在塞法戴克斯 G-150(过细的）的这 96 X 2.5个 cm 柱上是在 5 的流率毫升h 以标准的缓冲液平衡而且洗提。爵士HP 的活性在两个主要的蛋白质的第二个中出现峰巅。部分的特定的活性 6 单位毫克或比较棒的被告发了，以胶棉集中了至 4 毫升袋仪器，而且透析了对抗 0.01个 M 磷酸钾缓冲液，酸碱值 7.7, 包含 0.1毫莫耳 Na2 乙二胺四醋酸。这一个步骤提供特定的活性12 折层的增加而且第一个后的 68% 的总计的出席活性的恢复DEAE 步骤。被透析的酶被应用到这 24 X DE52 的 1.5个 cm 柱了以透析缓冲液平衡而且以 600-毫升线性洗提0.01-0.03个 M 磷酸钾的倾斜度，酸碱值 7.7, 包含 0.1毫莫耳 Na2 乙二胺四醋酸。部分的 4 毫升为濥的活性被化验而且为吸光度的蛋白质在 280个 nm。濥的活性是以一种相对持续的特性洗提当做一个蛋白质的山顶在一个大约 0.017 M 的磷酸盐浓度的活性。包含 0.5 单位活性 0.5 单位活性更多的部份被告发了和集中了至超滤的 1 毫升。棕红溶液在 48,000 X g 为 1 h 被离心分离机而且广泛地透析反对标准的缓冲液。这一个最后一个步骤提供特性的1.5 折层的增加用对柱是应用的 57% 的活性的恢复的活性。全部的洗净，在表 11 概述, 产生 25 单位活性在 0.9 毫克蛋白质中从 130 克电池而且表现一2500 折层的总数洗净用活性的 17% 恢复呈现在天然的萃取物中。酶在洗净期间是马房，和被净化的准备的储藏在 -15达 18个月的 C没有造成了活性的损失。实验在下面描述是以一个特定 26-28 活性在酶准备上运行单位毫克。沉积速度测量超速离新法是在 Beckman 模型 E 中运行装备的超高速离心器电子的速度和温度控制单位和一个光电比色计用多工器补助物的扫描仪。蛋白质溶液广泛地透析对抗叁考溶剂而且离心分离机在 44,000转/每分在 25C. 沉积速度从测量被决定吸光度在第 278 和第 390个 nm 而且被改正到这密度和水的黏质在 20 点 C。频谱吸收的频谱在 23 点被记录了 C 在石英电池中1 cm pathlength 以 Aminco DW-2 双重梁分光光度计。EPR 频谱在 0.32 cm 的圆筒形管中被记录直径用在 X 操作的一个 Varian E9 分光计联合与田地 100 仟赫的调音。爵士的冷冻样品HP，包含0.5-0.6 在 0.05个 M 磷酸钾中的毫克毫升， 0.1 毫莫耳 Na2 乙二胺四醋酸，酸碱值 7.7 ，在 10 K 被空气产品所维护液体氦低温保持器。去氧核醣核酸方法重组细胞的去氧核醣核酸方法是 Maniatis 的使用酶和试剂的等人 （32) 从毕士大购买研究实验室、国际的生物科技公司，新英格兰Biolabs 、和 Pharmacia LKB 生物科技公司去氧核醣核酸序列被 dideoxy 方法 （33) 用 deoxyadenosine 5 运行了-（一35S thio）triphosphat （e 34)从 Du 缆拉渡船公司独身者搁浅的去氧核醣核酸型板也被次复制限制核酸内切限制所获得在抗菌素 M13 衍生物 （35) 中的碎片或被这产生交叠处理划除的山谷等人 （36) 的方法。在序列反应的一些例证被开始了在一里面次复制的oligodeoxynucleotide 入门书的使用的碎片准备与自动化去氧核醣核酸合成器的应用的生物系统型号 380 A。去氧核醣核酸序列比较用计画比较， DotPlot，BestFit 、和序列分析软件的 Codonpreference威斯康辛州的遗传学计算机小组大学的包裹（37).蛋白质的方法蛋白质的浓度被决定了被这缩二方法的 Zamenhof（38) microadaptation，藉由修正被 Krueger 和 Siegel 描述。（29)牛族的血清白蛋白，被化验的 spectrophotometrically 用 012 使用,=6.7 cm”(39), 是用当做一个蛋白质的标准。胺基酸分析被运行了依照 Spackman 等人 （40) 和一个 Beckman 模型 120 B自动机械胺基酸分析器。已知量 Lnorleucine 是增加当做对然后被加水分解了的每个蛋白质样品来说的一个标准在 uacuo 中的 6 N HCl 中为 28,48, 和 72 h 在 110C. 一半胱胺酸当做 cysteic performic 后的酸酸化氧化作用被决定, （41)而且白胺酸在蛋白质上被估计 spectrophotometrically（42)广泛地被透析对抗 6个 M 胍的样品HCl 除去辅基。我们的方法为溴化氟蛋白质的消化， HPLC 的缩氨酸的洗净、和气体状态缩氨酸序列 （43) 已经被描述. （44)其他方法SDS页被运行如 Laemmli 所描述了（45), 和蛋白质的带与库马西一起沾染蓝色的。Antisera 对爵士HP 藉由注射新西兰被准备白色的兔子用 Freund 中的 0.5 毫克大肠杆菌爵士HP 的课程完成辅药，一半在后面的脚填补中和一半地皮下地在多个位置。两只兔子的浆液是被获得的 14 和 17 天稍后而且被这发现包含使抗体陷入Ouchterlony 加倍 immunodiffusion 的技术。情况为酶样品的厌氧 photoreduction 当做描述被Janick 和 Siegel. （46)质体改为暗码的蛋白质被识别了被Sancar 等人的 maxicell 方法. （24)紫外线照耀的电池CSR603 携带不同的质体在 37 被抱了 C 为 18 h要促进染色体去氧核醣核酸的解离然后为 1 h 与-Smethionin. （e 1 Cimmol； Amersham 公司）Radiolabeled 蛋白质被 SDS页和自体放射照相术识别了。结果S 的描述。typhimurium 爵士HP这净化S。typhimurium 爵士HP 的准备催化 MVHdependent亚硫酸盐的还原反应，和在 presenceo f 过度中S。typhimurium 爵士FP，还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸依赖的还原反应亚硫酸盐。两者活性被与 SiRHP 的相较了起源于大肠杆菌爵士全濥的尿素分解。这两个蛋白质的特定活性是 22 单位毫克（S typhimurium）和 20 单位毫克 （大肠杆菌）为 MVH亚硫酸盐cysJIH 描述和亚硫酸盐 Reductase 血红素蛋白 15729reductase；而且 9.0 单位毫克为两者蛋白质在爵士FPdependent 中还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸亚硫酸盐的 reductase 化验。爵士以来全濥与大肠杆菌展现一个 2.9 单位的特定活性毫克 （4) 与些微地较少的超过三分之一它大众的适当到爵士HP 的原体 （5), 它是表观的那组合隔离的爵士HP 用过量的爵士FP 允许完全的再组织还原型烟胺腺嘌呤二核酸磷酸亚硫酸盐 reductase 活性。S。typhimurium 和大肠杆菌爵士HP 的酶每个在 SDSPAGEw 上展现了一个锐利的 bando f 蛋白质， hich以含 kDa 63 的的表观块移动了。Ouchterlony两倍 immunodiffusion 以被准备的 antisera 分析对抗大肠杆菌爵士H：P 表示沈淀素弧近的为两者准备的身份。沉积速度实验，在哪一个 S 的 0.6个 nng毫升溶液。typhimurium 或 E。在标准的缓冲液的 coli 爵士HP 同时地被离心分离机在44,000 转/每分在 20 点 C ，产生了同一的单一边界与sP，+, = 在两者第 278 和第 390个 nm 的 4.3 S。这结果标示那一爵士HP 存在当做溶液的一个单体，是否它是从 S 隔离。typhimurium 不包含的 cysJ 266全濥，或藉着大肠杆菌爵士全濥的尿素分解。胺基酸 S 的分析。typhimurium 和大肠杆菌爵士HP准备几乎同一的 （表 111) 。虽然前面的结果标示那 S 。typhimurium爵士HP 的准备对大肠杆菌完全可比较纯度、催化活性和物性的州的准备，它兴趣二个在吸收中有一些不一致和EPR 频谱。图 2 表示吸收二个的频谱不同S 的准备。typhimurium 是同一的酶在特定的活性中。对于两者准备这光学的在区域的光谱 260-300个 nm 展现了一个吸收最大的在 278个 nm 而且在形式中是同一的（不显示）先前对那为大肠杆菌爵士报告准备的 HP 被尿素爵士全濥的分解. （5)e% 数值是14.6 和 14.4 为 S。typhimurium 准备 A 和 B，分别地，使用被修正的 microbiuret 程序 deTABLE11 1推论的 cyszpeptides 的胺基酸成分和净化S 的爵士HP。typhimurium 和大肠杆菌 BS。typhimurium 大肠杆菌 B胺基酸推论分析 推论分析 残留物Ala 49484749Arg 4142!4143山杨 Asn 57626063CYS 6666Glu Gln 619616165GlY 48514952他的 161;191616Ile 38353835罗马尼亚的货币单位 5654:5351LY s 34:363536被遇见的 1 c， 12191413Phe 21202020职业者 2Ei 292728重量的单位 1 yd 171616 d36 d 3 T4-h r 3535 d第一 Trp t 687Tyr 141414142928 V al 3028”每一 64,000个分子量计算当做残留物从一任一 S 的爵士HP 的分析。typhimurium cysJ 266(这一个工作）或爵士HP 从大肠杆菌 B 净化. （5)测量当做 cysteic ；用 performic 酸的化氧化作用后的酸. （41)胺基末端甲硫胺酸残余物不是出现在这成熟的蛋白质。根据插补法估计至对准零位水解的时候。e 决定了 spectrophotometrically 。（42)o 。o400500600700波长（nm）图 2.S 的光学频谱。typhimurium 爵士HP 在而且在一个 photoreduction 和再化氧化作用的周期之后。酶准备在标准的 0.56 毫克毫升 （基于一 278) 在场了缓冲液为准备 A 而且在标准的缓冲液中加 1.5 p 5-deazaflavin， 10 毫莫耳乙二胺四醋酸为准备 B. 光谱准备 A（-) 需气地被获得对抗一个标准缓冲液留空白。给准备 B 的频谱被记录对抗标准了缓冲液包含下午 1.5 点 5deazaflavin 和 10 毫莫耳乙二胺四醋酸。这准备 B（.) 的厌氧光谱是不能辨别的从需气地在 5 缺席中获得deazaflavin乙二胺四醋酸。因为还原反应和再化氧化作用，厌氧的陶盆包含准备 B 样品和它的控制空白被放置了在一个色层分析法箱装满冰水（避免过热）而且和将军为 60 多岁对照明的期数服从电的 200个瓦特 狭窄的地点 封闭了梁灯。（46)在每个之后照明的周期，样品从浴被移动和光学的频谱记录跟随 photoreduction 的进步酶。照明被继续直到没有较进一步的变化了被发现而且造成一种光学的光谱了与那相同完全减少大肠杆菌爵士HP. （见到裁判员的图 1 46)两者溶液然后被打开晾干制的了，和光学的光谱（酶对控制）被记录了. （-)为测定在 实验的程序 之下划线蛋白质浓度。大肠杆菌爵士HP 产生了 ti14.6 当根据相同的程序分析。在 392个 nm 当做 oret 山顶展现的准备 A，一一带在 588个 nm，在 714个 nm 的一个小电荷转移带，和一27 多岁Asomt 1.74;准备 B 展现了一个 Soret 山顶在405个 nm，一一在 585个 nm 联合，事实上没有电荷转移联合，和 A 278|一或et 1.89.s 的第三准备。typhimurium 爵士HP（不显示）展现了一种光学的光谱几乎同一对准备 B. 没有一种光谱大肠杆菌爵士和相同有 Soret 的 HP而且一带在第 386 和第 591个 nm 的峰巅，显着的 chargetransferbanda t 714个 nm 、和言论集 278|ASomt 1.63.(47)这些结果指出在准备 B 的血基质实质上在非高度旋转方面铁的会解释的州电荷转移带的缺席和变化在这Soret 山顶对较高的波长，和哪一血基质在当做一个高度旋转的混合存在的准备 A 和非高的旋转铁的说。这被 EPR 分析确认了这两 S。typhimurium 准备和大肠杆菌爵士HP。所有的三以 g 在 10 K 产生了性质上同一频谱数值特性高度旋转在 g 的 ferriheme 6.63,5.24,而且 1.98.g 的强烈 6.63个峰巅不一致显着地，然而，藉由 S。typhimurium 准备 A 和B 成绩 65% 和 15%, 分别地，大肠杆菌爵士HP数值。大肠杆菌爵士HP 先前已经被显示本质上完全地在高度旋转 ferriheme 州当做隔离. （47)没有EPR 作信号可归于到低的旋转 ferriheme 被发现了在这些准备之中的任何一个中。然而，早先的工作（47,48)15730 的 cysJIH 描述和亚硫酸盐 Reductase 血红素蛋白已经显示大肠杆菌爵士HP 的一些低旋转合成物ferriheme 用外生的配位体，举例来说是亚硫酸盐和亚硝酸盐，是实质上 EPR 沈默的。这些结果指出 cysl 爵士HmP 的赞成票是隔离当做一个自由酶的混合了和一个合成物与一些配位体。Soret 的位置和一在准备联合B 是一致的与可观量的一使氧化siroheme亚硫酸盐合成物，因为吸收 spectrumo f大肠杆菌爵士HP 的合成物用亚硫酸盐展现 Soret anad 在第 408 和第 583个 nm 联合极大值，分别地，没有 714个 nm电荷转移带，言论集 27R一或e t 1.94, 而且本质上EPR沈默的在我们使用的实验的情况之下（47,48).S 以来。typhimurium 爵士HP 的准备被似乎接触反应地变得完全活性，如此的一个合成物，如果礼物，应该在情况之下被转换到自由的酶在哪一个范围亚硫酸盐被转为硫化物，这有为爵士HP 的一个相对低的亲和力. （48)要测试这一种可能性我们使 S 的一个样品服从了。typhimurium 爵士HP准备 B 对在 presencoef 中的厌氧 photoreduction乙二胺四醋酸和 5-deazaflavin，如 Janick 和同事所描述（46,48), 然后打开了溶液晾干制的到再使氧化酶。此时 H2S 的清楚气味是表观的，哪一个在大肠杆菌爵士HP 中不被注意抽取样品在 samew 赞成票中治疗。在还原反应再化氧化作用之后，这准备 B 酶 （图 2) 的光学光谱包含Soret，一，和在位置的电荷转移吸收峰巅与大肠杆菌爵士的相同HP，而且有言论集 ZTR因为，retv 是特性的 1.63 alue 这不合成物ferriheme 酶。减少再使氧化 S 的 EPR 分析。在 10 K 的 typhimurium 准备 B 溶液表示那这高度旋转 ferriheme resonanceas t g 6.63,5.24, 和 1.98 现在被展现的 83% 的强烈发现与一类似的大肠杆菌爵士HP 的浓度。当对一个周期服从photoreduction 和再化氧化作用，大肠杆菌爵士HP 展现高度旋转 ferriheme 作信号，这是 91% 的强烈untreatede nzyme。光学的 anEdP R 方面的相似改变频谱被获得了何时一。typhimurium 爵士HP 的准备藉由对那几乎同一的一种光学的光谱准备 B 被以过量的 MVH 治疗了（0.2 毫克毫升酶和 0.1 毫莫耳 MVH）厌氧地 10 分钟在 23 点 C，打开晾干制的，然后透析除去甲基 viologen。因此，我们能在 S 中总结那复合剂。typhimurium 爵士HP 的准备能被释放在这一个还原剂的出现。分光镜的特性，连同表观 productoifo 一起拿 snu lfide 下列各项还原反应，标示这一个复合剂或许亚硫酸盐。pGBK 5 中的 cysJIH 区域的组织-S。typhimuriumAcysJIH383 携带任一 pGBK 5 o r pJYW 2 是 Cys标示这些质体包含整个的 cysJIHS 的区域。typhimurium 和大肠杆菌 B，分别地。不同的pGBK 的部分 5个插入物被次复制了进入pBR 322 而且测试让他们的能力补助 S。typhimuriumcys 突变异种和为质体的表达改为暗码在 maxicells 中的蛋白质. （24)pGBK 5 被发现改为暗码了在最少五个不同的缩氨酸用 SDSPAGE 的表观块27,31,38,63, 和含 kDa（图 3)66 的.66- 和 63-kDa 缩氨酸试验性地被确认为 cysJ 了 ancdy sI基因产品，分别地，因为他们 comigrated 与这爵士FP 和净化的爵士全濥的爵士HP 原体从大肠杆菌 B（没被显示的数据）.31 kDa 的缩氨酸是表达所有 AmpR 质体测试了而且表现 thep 被 pBR 322 改为暗码它本身的内醯氨?。pGBKll 包含一个 5.8 kb 的 EcoRISal1 的碎片从pGBK 5 而且不同于被它的无能的这一个质体到表达 maxicells（图 3) 和失败的 66 kDa 的缩氨酸6663 kkDDaa 含 kDa 38 的pGBK 5 pGBKll WOK20 plOK 21 WOK22图 3.maxicells 中的改为暗码质体基因的表达。CSR603 的文化携带任一 pGBK 5 、 pGBK 11 ， pJOK 20,pJOK 21, 或 pJOK 22 被当做了描述被 Sancar（24) 和radiolabeled 用 LSlmethionine。五个不同的质体改为暗码蛋白质被 SDS页和自体放射照相术识别了。Th6 e 6-而且 63-kDa 蛋白质用爵士FP 和爵士HP 联合 comigrated大肠杆菌 B 爵士的原体而且是被假定的 tboe productso f cysJ而且 cysl，分别地。31 kDa 的带表现-改为暗码的内醯氨?被 pBR 这些质体的 322 部分。结果指出或 27- 或 38 kDa 的带是 thec ysH 产品。质体荃因型缩氨酸 IkD.1cySr eyrl cysl 2738 366 + t 不作试验 +-+- - t +- t t1:：01.8210 我 Z 1.kbPJyw2B P 我P 08113不测试图 4.cysJ 、 cysl 和 cysHby 遗传基因的互补局限而且 maxicell 实验。O nly 复制的插入物藉由有关的限制位置被显示。完全地是 pBR 322个衍生物除了起源于 pUC 19 的 pJOK 23 以外.荃因型是根据遗传基因的互补测试，以 S 决定。typhirnuriumAcysJIH383 、 cysJ 266 、 cysI 68 和 cysH 75.质体改为暗码的缩氨酸在 maxicells 中被识别。（见到图 3)所有质体表达一 31-kDa p内醯氨? 的缩氨酸. （不标示）大约的位置cysJ 、 cysl 和 cysH 在 pGBK 5张地图之下被显示。为比较， pJYW 2 的大肠杆菌 B 插入物在显示之下被刻度而且对去氧核醣核酸序列被排列对抗 pGBK 5 inserta ccording身份. （见到图 6)缩写是：S， SalI；R， EcoRI；K，KpnI；P， PstI；H， HindIlI；B，BarnHI。被指定 BS3 的位置是在 Sau3 A 之间从一个结扎形成了和 BarnHI 位置而且是反抗的对 BarnHI。补助 AcysJIH383 和 cysJ 266(图 4) 。这标示那一个部份或 oafl Sl 。typhimurium cysJ 被位于到这在图 4 和支持的 7.2 kb 被显示的 EcoRI 位置左边我们的 66 kDa 缩氨酸的确认当做爵士FP 的去辅基蛋白质藉着 cysJ 改为暗码。包含 9.2-kb 的 pJOK 20SalI雌鹿 pGBK 的 111个碎片只有被表达的 5个插入物66-, 63-, 和 31 kDa 的缩氨酸 （图 3) 而且补助除了 neitherA cysJIH 383 也不 cysH 75 之外的 cysJ 266 andcy sI 68.这些调查结果对