自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.doc

自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等-1, 4-葡聚糖，水解-1, 4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断-1, 4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性1, 2。除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。Ueda3, 4，Mizokami5，Tamiguchi6，Kainuma7先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus. sp，Strepiococcus boris，Bacillus circulans， Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。本实验拟从种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm25cm土层取土壤样品中分离土壤微生物，筛选能产生淀粉酶的菌种，并进行初步鉴定8。同时，拟进行发酵条件的优化以提高菌株的酶产量，分离提纯产生的淀粉酶并进行酶活力测定，为利用该菌株进行工业化生产淀粉酶提供初步的理论依据。1. 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 分离材料种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm25cm土层取土壤样品。1.1.2 培养基(1) PDA 固体培养基9：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL。pH 5.56.5 之间，121 灭菌 20 min。(2) 平板筛选培养基：牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，可溶性淀粉 20g，琼脂 1520g，pH 自然，121 灭菌 20 min。(3) 发酵培养基10：蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，NaCl 10g，pH 7.0，121 灭菌 20 min。(4) LB培养基：蛋白胨 10g，酵母膏 5g，NaCl 10g，琼脂 20g，pH 自然，121 灭菌 20 min。1.1.3 主要试剂配制 DNS试剂11：酒石酸钾钠18.2g，溶于50mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3, 5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100mL，贮于棕色瓶中，室温保存。 CTAB 法所用主要试剂：提取缓冲液: 2CTAB提取液（2%CTAB，200 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 50 mmol/L EDTA(pH8. 0), 1. 4 mol/L NaCl）；10CTAB 提取液(10%CTAB, 0.7 mol/L N aCl)；TE 缓冲液: 100 mmol/L T ris-HCl (pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)。 电泳缓冲液：取50TAE（242 g Tris碱和57.1 mL冰乙酸溶于100 mL 0.5 mol/L的EDTA(pH8.0)溶液中，加去离子水至1000 mL）20 mL加蒸馏水至1000 mL；溴化乙锭(EB)：称取5 g溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)，溶于蒸馏水中并定容到10 mL，避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍，使其最终浓度达到0.5 g/mL；1.0%的凝胶：称取琼脂粉1.0 g，加热使之溶于100 mL的电泳缓冲液，加入5 L EB，混匀。氨苄青霉素（Ampicillin）（100 mg/mL）：溶解1 g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10 mL。分装成小份于-20贮存。以50 g/mL的浓度添加于生长培养基。大肠杆菌质粒提取相关试剂：溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA；溶液II：0.2 mol/L NaOH，1%SDS混合液(使用前新配制)；溶液III：5 mmol/L KAc溶液pH 4.8；去离子水：双蒸水灭菌得到；酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）；无水乙醇；75%的乙醇。 克隆相关试剂0.05 mol/L CaCl2溶液；含15%甘油的0.05 mol/L CaCl2溶液；克隆克隆试剂盒(宝生物工程有限公司)：pMD19-T Vector*1(50 ng/L)，contor insert (50 ng/L)，Solution I、X-Gal、IPTG、Amp。 1.1.4 主要化学药品和试剂本实验中用到的主要化学药品和试剂如表1-1所列。表1-1 主要化学药品和试剂名称纯度来源蛋白胨分析纯杭州微生物试剂有限公司牛肉膏分析纯杭州微生物试剂厂硫酸铵分析纯上海化学试剂有限公司氯化钠分析纯杭州高晶精细化工有限公司葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司酒石酸钾钠分析纯金山区兴塔美兴化工厂3，5-二硝基水杨酸分析纯上海晶天生物科技有限公司苯酚分析纯杭州双林化工试剂厂氢氧化钠分析纯上海虹光化工厂盐酸分析纯杭州高晶精细化工有限公司PEG 1000分析纯杭州高晶精细化工有限公司PEG 6000分析纯杭州高晶精细化工有限公司可溶性淀粉分析纯广东.汕头市西陇化工厂无水乙醇分析纯杭州长征化工厂氯化钙分析纯上海化学试剂有限公司Tris碱分析纯杭州南天生化试剂经营部冰乙酸分析纯杭州高晶精细化工有限公司异戊醇分析纯杭州高晶精细化工有限公司溴化乙锭分析纯杭州高晶精细化工有限公司醋酸钠分析纯杭州高晶精细化工有限公司EDTA分析纯广东山头市西陇化工厂SDS分析纯广东山头市西陇化工厂结晶紫实验室自配碘液实验室自配番红实验室自配琼脂粉细菌级杭州微生物试剂有限公司1.1.5 主要仪器设备本实验中用到的主要仪器和设备如表1-2所列。表1-2 主要仪器和设备名称型号制造商或产地电子天平（BS323S）北京赛多利斯仪器系统有限公司酸度计（DeLta320）瑞士梅特勒-托利多加热恒温鼓风干燥箱（DGG-9070B型）上海嘉信实验仪器有限公司超净工作台（SW-CJ-2G）苏州净化设备厂电子显微镜（Nikon YS100）尼康映像仪器销售(中国)有限公司高压灭菌锅（YXQ-280 SD型）嘉兴市中新医疗仪器有限公司生化培养箱（SPX-250B-Z型）上海博逊实业有限公司医疗设备厂台式冷冻恒温振荡器（THZ-C-1）太仓市实验设备厂PCR自动系列化分析仪(Biometra)德国Biometra海尔冷藏柜（SC-209)青岛海尔电器集团公司1.2 实验方法1.2.1 淀粉酶产生菌分离方法：涂布接种法12。1.2.2 淀粉酶产生菌纯化方法：平板划线法。1.2.3 淀粉酶产生菌初步鉴定方法：革兰氏染色。1.2.4 淀粉酶产生菌产酶条件优化：单因素法11, 13-14。根据几种变量来优化产酶条件：改变基础发酵培养基中氮源，碳源或是NaCl等的浓度。1、不同碳源对酶活的影响 以蛋白胨为氮源，改变基础发酵培养基中碳源的种类，配制液体发酵培养基。121 灭菌20 min以250 mL三角瓶装液50 mL发酵培养基，按0.5的接种量接种12 h种子，37，160 r/min摇床培养36 h后测定粗酶液酶活。2、不同氮源对酶活的影响 以麸皮作为碳源，改变基础发酵培养基中氮源的种类，配制液体发酵培养基。3、不同NaCl含量对酶活的影响 改变基础发酵培养基中NaCl的浓度，配制液体发酵培养基。4、初始发酵温度对酶活的影响 基础发酵培养基，121灭菌10 min。考虑到菌株的生长温度范围是2850，故以28，37，45，作为培养温度，以250 mL三角瓶装液50 mL发酵培养基，按0.5的接种量接种12 h种子，37，160 r/min摇床培养36 h后测定粗酶液酶活。5、培养基初始pH对最终酶活的影响 基础发酵培养基，121灭菌10 min。考虑到菌株的生长pH范围是4.79，故在pH 410范围内测定酶活。6、碳氮比对产酶的影响 以麸皮作为碳源，黄豆粉作为氮源配制液体发酵培养基。1.2.5 粗酶提取物的制备：双水相萃取法15。双水相萃取系统系在室温(222)下按重量配制。在50 mL烧杯中加入所需重量的硫酸铵和氯化钠，PEG 1000和PEG 6000以50浓溶液形式加入，预处理发酵液均按系统总重量的50加入。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH，体系总重量为10g，不足部分以自来水朴充。各组分的浓度均用重量百分含量表示。用玻璃棒搅匀烧杯中混合物，定量转至10 mL刻度离心管中，然后于2000 r/min离心2 min分层。此时淀粉酶和蛋白酶分配到上、下两相，发酵液中不溶物和菌体以固体物形式集中在两相之间。读出上、下两相体积，用注射器分别吸出一定量的上、下两相溶液，测定酶活和总蛋白含量。1.2.6 酶活力测定：等量对照法16-17。酶活性的测定取洁净的试管若干，作好标记，每一种提取物设1个对照。总反应体积为0.5mL，测定管含0.2 mL的酶提取液和0.3 mL的1%淀粉溶液；对照管含0.2 mL的酶提取液和0.3 mL的0.1 mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)。将试管放入恒温40的水浴锅中，保温30 min后取出，立即加入1.5 mL的DNS试剂终止反应。再将试管置于沸水浴中10 min，取出后冰浴冷却。取反应液稀释10倍，测定波长520 nm处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。2. 主要技术路线主要技术路线如图2-1所示：分离土壤菌种纯化土壤菌种筛选淀粉酶产生菌菌种保藏革兰氏染色菌种复活记录、分析讨论实验结果不同条件下菌种发酵测定酶活力制备淀粉酶提取物DNA提取克隆（目的基因导入)受体细胞）16S rRNA PCR扩增筛选，检测PCR产物回收目的基因测序图2-1 主要技术路线3. 预期结果本实验首先通过涂布接种、平板划线等方法从土壤样品中分离得到土壤微生物，然后经过筛选培养基上培养筛选出淀粉酶产生菌。选取产酶能力强的菌株，采用单因素法对筛选的淀粉酶产生菌进行发酵工艺优化，通过酶活力测定确定该淀粉酶产生菌生产的淀粉酶的活性，分析所得淀粉酶粗提物的质和量确定该菌株产淀粉酶的最优条件。通过对16S rRNA序列分析确定该菌的种属。4. 参考文献1 Sasaki H et al. Taxomyces andreanae a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with pacific yew (Taxus brevifolia) J, l996, 50: 1661-1664.2 Hayashida S et al. Acremonium sp. a leucinostatin A producing endophyte of European yew (Texus baccata) J, 1999, 53: 143-149.3 Ueda S. In vitro studies of endophytic fungi from Tripterygium wilfordii with antiproliferative activity on human peripheral blood mononuclear cells J, 1997, 21-284.4 Saha B C and S Ueda. Taxomyces andreanae a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with pacific yew (Taxus brevifolia) J, 1993, 61: 67.5 Mizokaml K. New bioactive metabolites produced by Colletotrichttm sp. an endophytic fungus in Artanisia annua J, 1999, 51: 299.6 Tamiguchi H et a1. Three new cytochalasins produced by an endopbytic fungus in the genus Rhinocladiella J. 1992, 48: 210.7 Kainuma K et a1. new antibiotic and cytotoxic dimmers produced by the fungus homopsis longicolla isolated from an endangered