蛋黄的测定 文档.doc

蛋黄中胆固醇含量测定方法的研究胆固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法等试剂盒法是基于酶法测定胆固醇的原理进行的比色法一种依据显色反应来分析的传统方法色谱法是适用范围较广、灵敏度较高的分析方法而高效液相色谱不需要载气在使用上较气相色谱和液相色谱-质谱联用的方法简便 6-11 。本试验对液相色谱法、皂化-比色法和试剂盒法测定蛋黄胆固醇的过程和结果进行研究和比较为鸡蛋胆固醇含量测定工作提供方法指导。1材料与方法1.1试验材料蛋黄由市售新鲜鸡蛋中取出胆固醇标准品纯度99.7%由中国计量科学研究院提供总胆固醇试剂盒酶法由北京北化康泰临床试剂有限公司提供显色液为FeSO4-冰乙酸-浓硫酸将FeSO4100 mg溶于1mL蒸馏水中再加入100 mL冰乙酸混合溶解然后与100 mL浓硫酸缓慢混匀冷却后使用。1.2试验方法1.2.1 HPLC法取新鲜蛋黄稀释液浓度为0.1 gmL-1 1.0 mL于10 mL离心管中加入95%乙醇1.0 mL用漩涡振荡器混匀后加入乙醚2.5 mL再次混匀后加入石油醚2.5 mL震荡混匀3 000 rpm离心5 min移出上层萃取液在低于45下用氮气吹干加无水乙醇溶解残余物2.0 mL用0.45m有机微孔滤膜过滤后进样。色谱条件为色谱柱ZORBAXEclipse XDB-C184.6 mm150 mm5m流动相乙腈-异丙醇(4:1)V/V流速0.8 mLmin-1柱温35检测波210 nm进样量10L。取胆固醇标准品用色谱级无水乙醇溶解配成浓度为1 mgmL-1的标准液取标准液稀释成不同浓度01 000gmL-1以胆固醇浓度为横坐标峰面积值为纵坐标制作标准曲线。采用外标法定量分析样品中胆固醇含量。1.2.2皂化比色法 称取鲜蛋黄100 mg于25 mL试管中加入KOH-甲醇溶液5 mL200 gL-1漩涡震荡混匀置于80水浴恒温振荡器中皂化10 min取出冷却至室温加入正己烷10 mL漩涡震荡混匀静置将上层液体移入10 mL离心管中3 000 rpm离心10 min取出上清液60下用氮气吹干。然后加入冰乙酸1 mL溶解残余物再加入显色液3 mL于60水浴15 min在490 nm下用722分光光度计进行比色分析同法做空白样。将胆固醇标准品用甲醇溶解配成1 mgmL-1溶液取不同体积胆固醇标准品溶液与样品做同样处理以胆固醇浓度为横坐标吸光度值为纵坐标制作工作曲线。根据样品的吸光度值计算样品中胆固醇含量。1.2.3试剂盒法 样品前处理方法同1.2.1根据试剂盒说明将样品与工作液混合37保温5 min后在波长500 nm处比色测定吸光度值并根据样品管和校准管的吸光度值及校准品浓度计算胆固醇含量胆固醇含量=测定管吸光度值校准管吸光度值校准品浓度11.2.4加标回收率的测定量取0.1 gmL-1新鲜蛋黄稀释液0.5 mL或新鲜蛋黄50 mg加入1 mgmL-1的胆固醇标准液750L按照上述3种方法进行处理并分析根据结果计算加标回收率。计算公式见式 回收率=a-bc100%（a为测得加标样中胆固醇的量、b为样品中胆固醇的量、c为加标量。）1.3数据处理采用Excel 2007和SPSS 16.0统计软件进行数据处理和分析结果以“平均值标准误”表示。2试验结果2.1HPLC法测定蛋黄胆固醇含量样品的高效液相色谱图见附图。由附图可知胆固醇的保留时间为14.662 min。2.2测定结果比较3种方法测定结果见附表。通过对3种方法的比较发现HPLC法的测定结果低于皂化-比色法但差异不显著P0.05而试剂盒法的测定结果较HPLC法高P0.05这与Nogueira的结果相一致。【12】目前我国产胆固醇试剂盒均为血清总胆固醇试剂盒其测定原理是胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下生成胆甾烯酮再与氨基安替吡啉反应生成红色醌化物醌化物颜色深浅与胆固醇含量成正比试剂盒法测定结果较高的原因可能是蛋黄中固醇以外的甾醇类物质也同氨基安替吡啉反应生成有色物使测定结果偏高13。HPLC法测定蛋黄胆固醇结果的偏差最小方法的重现性和再现性也好于其他两种方法因而HPLC法的精密度较高。皂化-比色法的偏差较大其原因可能是此法采用皂化、显色等多步操作增加了由仪器、试剂和操作等方面带来的系统误差另外蛋黄中胆固醇以外的物质也可能与硫酸反应而生成有色物给测定结果带来干扰。试剂盒法的精密度最低这可能与蛋黄样品中干扰物质较多有关。在样品中加入胆固醇标准品分析加标回收率的结果表明HPLC法的回收率最好因而准确度最高皂化-比色法居中试剂盒法的准确度最低。皂化-比色法的加标回收率偏低可能与胆固醇皂化不完全有关皂化时间短样品中胆固醇未能被完全皂化但皂化时间长又可能会使样品中增加胆固醇以外的皂化产物而干扰测定结果。试剂盒法的加标回收率偏高一方面与甾醇干扰有关另一方面本研究采用手工量取试液在722分光光度计上进行分析而非全自动机器操作增大了系统误差。3讨论3种测定方法中HPLC法以其高效、高速、高灵敏度的特点成为测定蛋黄胆固醇含量最准确的方法皂化-比色法检测虽然不需要昂贵的仪器但显色液使用浓硫酸配制使用和分析过程中有一定危险且蛋黄中干扰物质多使测定的结果偏差较大14。在采用皂化-比色法分析时为了提高结果的准确性本研究用胆固醇标准品制作工作曲线而非标准曲线即将胆固醇标准品做皂化和提取处理然后加入显色液整个处理过程与样品相同。目前我国产胆固醇试剂盒均为血清总胆固醇试剂盒用试剂盒测定血清胆固醇的方法已被广泛使用但用血清总胆固醇试剂盒测定蛋黄胆固醇含量存在结果偏高偏差大的问题。谭观岳等在对鳗鱼的试验中也得到相似的结论另有研究者将气相色谱法测定的结果与试剂盒法比较发现试剂盒法的测定结果也偏高而色谱法能够将胆固醇和其他甾醇有效的分离准确度高15-16。采用HPLC法测蛋黄胆固醇应使用新鲜蛋黄不宜使用冷冻蛋黄样品蛋黄冷冻后会发生凝胶化而很难均匀分散在水中样品处理后用0.45m滤膜过滤至EP管中尽量将EP管装满以避免胆固醇与氧气接触而发生氧化样品前处理时萃取液采用氮吹仪吹干亦可用真空干燥箱低温烘干流动相要脱气测样时保持柱温恒定避免保留时间偏移。附表3种测胆固醇方法比法HPLC法皂化-比色法试剂盒法胆固醇含量12.640.24b13.050.96ab14.701.29a相对标准偏差1.907.398.78加标回收率100.5695.47108.33注同列数据肩标不同小写字母者表示差异显著P0.05。4结论高效液相色谱法测定蛋黄胆固醇含量方法可靠、准确、简便重现性和再现性好。皂化-比色法的准确性较HPLC法低较试剂盒法高。用总胆固醇试剂盒测定蛋黄胆固醇含量的结果偏高不建议使用血清总胆固醇试剂盒来测定蛋黄的胆固醇含量。蛋黄中卵磷脂的测定自法国人从年从蛋黄和脑中发现含磷的脂类物质，并于年命名为卵磷脂（）以来，陆续从许多动植物中分离、确认了许多磷脂物质。年将磷脂酰胆碱从其他磷脂中分离出来。目前广义的”卵磷脂”堤将卵磷脂视作各种磷脂的同义词，或定义为”丙酮不溶物（即各种磷脂）在以上的一种极性和非极性脂类的混合物，其中包括磷脂酰胆碱（）、磷脂酰乙醇胺（）、磷脂酰肌醇（）、磷脂酰丝氨酸（）等磷脂和甘油三脂的混合脂类”。市售的”卵磷脂”即是广义的卵磷脂。从蛋黄中提取磷脂：鸡蛋每个质量为、蛋壳、蛋清、蛋黄。蛋黄由水分、蛋白质、脂类组成，其中脂类以脂蛋白形式存在。在脂类中磷脂占、中性脂肪、胆固醇。利用蛋黄中各成分在有机溶剂中溶解度的不同，采用溶解与沉淀相结合的方法提取磷脂。游离脂肪及胆固醇溶于一般的有机溶剂。磷脂可溶于氯仿、乙醚、石油醚、正己烷，不溶于丙酮和乙酸乙酯。蛋黄中的色素主要是类胡萝卜素，可以用乙醚、石油醚、丙酮等提取。综合考虑以上各因素，从蛋黄中提取卵磷脂可有以下两种思路：新鲜蛋黄丙酮提取直接用乙醇提取再用丙酮沉淀这种方法的操作因采用的原料而不同。（）以蛋黄粉为原料口直接将蛋黄粉与乙醇混合搅拌，过滤后，真空抽去溶剂，即得含卵磷脂以上的磷脂。（）以新鲜蛋黄为原料采用乙醇与蛋黄一起搅拌，过滤后，滤液用正己烷苯取以除水，用饱和食盐水洗数遍后，浓缩。以上两种方法得到的磷脂中，仍含有许多游离脂肪、胆固醇及色素，再用丙酮或乙酸乙酯（用乙酸乙酯做沉淀剂必须经过饱和食盐水洗过）沉淀数次，得到卵磷脂、脑磷脂及少量其他磷脂的混合物。直接用丙酮处理再用乙醇抽提【】由于蛋白质遇丙酮会变性而沉淀，磷脂均为丙酮不溶物，除此之外蛋黄中的其他成分均较好的溶于丙酮。因此可以直接将蛋黄粉或鲜蛋黄与丙酮混合搅拌后过滤，滤液中含有大量杂质及少许卵磷脂，弃去不要。再用乙醇抽提出磷脂。经实验比较，方法比方法的胆固醇、游离脂肪及色素脱除彻底。通过试验并综合考虑纯度、色泽、状态以及成本等因素，得出比较合理的路线如下：-路线图-对于作为食品用化学品（或添加剂）的”卵磷，在联合国的、美国的补充版（）、日本的公定书都有明确规定。这些测定方法多以丙酮不溶物、含磷量、乙醚不溶物等为指标，我们根据自身条件采用薄层层析法和测磷法删磷脂。（测磷脂总量）来确定所得产品中磷脂总量。实验部分原料蛋黄粉购自沪南蛋品厂，鸡蛋购自苏果超市，溶剂规格详见各操作。层析板为高效硅胶板，展开剂为：（）氯仿（用于胆固醇）（）氯仿：甲醇：水：（卵磷月4-）（）苯酚（）乙醚（蜘玎，）丙酮（5）水（）（卵磷脂.脑磷月旨）。胆固醇用硫酸显色，下加热数分钟产生紫红色斑点。磷脂用试剂显色，喷雾即显兰色。所有操作及产品均需N2保护。从蛋黄粉中提取卵磷将蛋黄粉置于浸出罐中，加入乙醇，搅拌后过滤，将过滤后残渣再加乙醇浸提并过滤如此反复浸提-次，即得纯度 的卵磷脂。3.2从新鲜蛋黄取卵磷脂将乙醇逐次少量加入新鲜鸡蛋，搅拌过滤得滤液，