第八章 疾病与人类健康.doc

第八章 疾病与人类健康肿瘤与癌症HIV与爱滋病HBV与乙肝基因治疗肿瘤与癌症良性肿瘤-不具有侵染性恶性肿瘤-具有侵染性, 可转移(1) 蛋白酶的表达(2) 肿瘤一般会分泌促血管生成素, 形成大量血管,获取营养(3)癌症致死原因-营养耗尽, 器官功能受损癌基因与抑癌基因癌基因的激活或过量表达-致癌抑癌基因的失活-致癌癌基因细胞转化癌基因(oncogene,c-onc)控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性 病毒癌基因(virus oncogene,v-onc) 病毒所携带的致转化因子 (RNA 病毒- 逆转录病毒; DNA 病毒) 细胞癌基因(cell oncogene,c-onc)即原癌基因(proto oncogene)：未激活的癌基因，促进正常细胞生长、增殖、分化、发育等 v-onc 与c-onc的不同V-onc 无内含子 外显子有微小差别 V-onc 常出现碱基取代或缺失等突变 癌基因家族1.蛋白激酶类: Src家族等2.生长因子类: Sis家族等3.生长因子受体类: Neu家族等4.GTP结合蛋白类:Ras家族等5.核蛋白类: Myc家族 , Ros家族等6.功能未知类: bcl-1等抑癌基因(tumor suppressor gene)正常细胞内，抑制细胞生长，潜在抑癌作用的基因此类基因突变、缺失或失活，引起细胞恶性转化，导致肿瘤调控细胞增殖和分化、负调节表达产物：跨膜受体、胞质调节因子、转录因子、细胞周期因子等癌基因和抑癌基因在细胞周期调控中的作用细胞周期及其调控 细胞间期(G1 期、S 期、G2 期) 和有丝分裂期 两个调控点：G1/S 转折点、G2/M 转折点 从增殖角度，细胞可分为三类 连续分裂的细胞：周期性细胞，如小肠绒毛上皮隐窝细胞 休眠细胞（G0 期细胞）：暂时脱离细胞周期，如肝、肾细胞 终端分化细胞：如神经、肌肉细胞 原癌基因在细胞周期调控中的作用 有些原癌基因是细胞周期蛋白的成员 抑癌基因在细胞周期调控中的作用 抑制细胞周期于静止期，并使复制不完全或受损伤的DNA 不能进入分裂期。 Rb基因 (第一个调控点G1/S)P53 基因(第一个调控点G1/S) 癌基因恶性激活的机制原癌基因点突变原癌基因基因获得外源启动子而激活原癌基因甲基化程度降低而激活原癌基因的拷贝数增加而激活基因易位或重排使原癌基因激活癌基因激活与肿瘤的发生肿瘤发生学说启动阶段、促癌阶段、演进阶段 癌基因激活与肿瘤发生 Ras 基因变异与肿瘤发生 Myc 基因变异与肿瘤发生 抑癌基因失活与肿瘤发生Rb基因P53基因P16基因肿瘤发生的多基因协同学说HIV and AIDSHIV and AIDSHIV and AIDS细胞基础HIV and AIDS 病 毒HIV and AIDSHIV and AIDSHIV and AIDSHIV and AIDSHIV and AIDSHIV and AIDSHIV - 病毒HIV - 病毒HIV - 病毒HIV - 病毒HIV - 生活史HIV - 生活史HIV 病毒进入CD4+ 细胞HIV - 生活史HIV - 生活史HIV感染的CD4 T 细胞的动力学HIV感染的CD4 T 细胞的动力学HIV基因组HIV的基因组TATREV潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期中断HIV 的其他问题CD4+ T4 细胞数量不可逆转的下降为什么所有的T4细胞在消失？为什么T4 细胞在消失?为什么CD8+ 杀伤细胞在消失?HIV 和自身免疫巨噬细胞可通过两种途径被感染巨噬细胞 - The Trojan Horse病毒的多态性病毒的多态性病毒多态性病毒的多态性HIV感染的其他CD4-细胞抗-HIV 的策略抗-HIV 的策略抗-HIV 的疫苗抗-HIV 的疫苗抗-HIV 的疫苗HBV与乙肝甲肝病毒-小RNA病毒其它肝炎病毒-RNA病毒乙肝病毒- DNA病毒 有部分单链区的环状双链DNA分子.HBV的复制-非半保留复制DNA- 修复- 转录RNA- 逆转录cDNA- 双链DNA一、基因治疗的概念 基因治疗（gene therapy）就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。对象： 体细胞 生殖细胞二、基因治疗的必要条件发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作理想的基因治疗还必须：外源基因可有效导入靶细胞外源基因能在靶细胞中长期稳定存留导入基因能适量表达导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害三、基因治疗的主要内容或策略基因标记(gene labeling)Neo基因，逆转录病毒载体基因置换（基因矫正）定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列基因添加（基因增补）导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因导入正常的基因补偿缺陷基因的功能导入新的基因，利用表达产物治疗基因干预(gene interference)指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。(mRNA,DNA)导入寡核苷酸抑制内源基因的表达反义核酸 封闭基因表达核酶 裂解特异的靶mRNA第二节 基因转移技术和靶细胞基因治疗的基本方式：体内直接转基因 体内法 in vivo体细胞介导的基因治疗 回体法 ex vivo基因转移的方法：生物学方法逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体非生物学方法脂质体，直接注射，受体介导基因转移技术，其它方法一、基因转移的生物学方法逆转录病毒载体：逆转录病毒载体的结构将病毒前DNA经适当改造并插入质粒后构建而成5LTR/ 3LTR包装信号（序列）Neo基因/ Ampr酶切位点（多克隆位点）包装细胞(packaging cell)将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒导入哺乳动物细胞，大量产生病毒包装蛋白。NIH/3T3三代包装细胞：2PA317CRIP逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转录出病毒基因组的部分序列、标记基因、外源基因，被包装成病毒颗粒。缺陷型的逆转录病毒颗粒一过性感染病毒滴度106CFU/ml以上逆转录病毒载体的特点：缺陷型的逆转录病毒感染细胞RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达只能感染处于增殖期的细胞安全性问题逆转录病毒感染的可能性污染的可能性逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合破坏细胞正常生长的必须基因/抑癌基因LTR激活原癌基因染色体重排激活原癌基因二、基因转移的非生物学方法脂质体直接注射受体介导基因转移技术其它方法脂质体( liposome )脂质体是由脂类形成的一种可以高效包装DNA的人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的脂质微球。其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，DNA由于细胞的内吞作用进入细胞。人工脂质体膜具有如下特点：与体细胞相容，无毒性和免疫原性可生物降解，不会在体内堆积可制成球状(0.0350 mm)，包容大小不同的生物活性分子可带有不同的电荷具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求直接注射方法：注射，包埋溶液类型对基因表达有影响：重组DNA可贮存于5%30%的蔗糖溶液中也可用生理盐水或PBS受体介导基因转移技术受体介导的细胞内吞作用特点：具有细胞、组织或器官专一性，配体只能被一些特异的细胞吞噬配体进入细胞的转移效率很高核酸运载工具：配体+多聚赖氨酸（PL）配体PL核酸脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）配体肝细胞 受体其它方法磷酸钙共沉淀法电穿孔法显微注射法基因枪法三、基因转移的靶细胞靶细胞的选择须考虑：最好为组织特异性细胞细胞较易获得，且生命周期较长离体细胞较易受外源基因转化离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活目前常用的靶细胞有：造血细胞皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿瘤细胞第三节 反义RNA、核酶和三链DNA在基因治疗中的作用 一、反义RNA反义RNA在基因治疗中的意义及需解决的问题反义RNA与特异的mRNA结合而调控其翻译体外合成反义RNA构建转录反义RNA的重组质粒受体介导反义RNA转移技术ASGPPL反义RNA应用前景安全性高反义RNA设计和制备方便具有剂量调节效应能直接作用于一些RNA病毒二、核 酶核酶的设计 靶序列无二级结构切割位点GUN容易与其它RNA互补结合核酶的应用核酶结构稳定可重复使用三、三链DNA三链DNA在基因治疗中的意义寡聚脱氧核苷酸（ODN）以DNA双螺旋分子的专一性序列为靶子，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止转录作用机制作用机制合成脱氧寡核苷酸（ODN）（同聚嘌呤或同聚嘧啶）DNA分子中同聚嘌呤 同聚嘧啶ODN也被称为TFO(triplex-forming oligo)技术关键TFO 的设计与