葛根素对低O2高CO2肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞线粒体途径凋亡的影响.doc

葛根素对低O2高CO2肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞线粒体途径凋亡的影响 作者：丁城 作者单位：温州医学院第一附属医院 呼吸内科，浙江 温州 325000 【摘要】 目的: 研究在慢性低O2高CO2情况下，葛根素对肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)线粒体途径凋亡的影响。方法:雄性SD大鼠40只，随机分为正常对照组(N组)、慢性低O2高CO2 2周组(H2w组)、慢性低O2高CO2 4周组(H4w组)、慢性低O2高CO2 4周+葛根素组(H4w+G组)，每组10只。TUNEL法检测PASMCs凋亡;免疫组化测定PASMCs线粒体细胞色素C(Cyt-c)释放量及胞浆Bcl-2、Bax含量;分光光度法检测肺组织匀浆caspase 9酶活性。结果:H2w组、H4w组和H4w+G组mPAP、RV/(LV+S)、PAMT、PASMCs胞浆 Bcl-2含量均显著高于N组(P 0.01)，Cyt-c释放量、Bax含量及肺组织匀浆caspase 9酶活性均显著低于N组(P 0.01);H2w组、H4w组各级PASMCs和H4w+G组肺弹力型动脉和肺微细动脉PASMCs凋亡指数显著低于N组(P 0.01)。H4w+G组mPAP、RV/(LV+S)、PAMT、肺弹力型动脉和肺微细动脉PASMCs 中Bcl-2含量均显著低于H4w组(P 0.01);弹力型动脉和肌型动脉PASMCs凋亡指数、Cyt-c释放量，肺组织匀浆caspase 9酶活性均显著高于H4w组(P 0.01);Bax含量在H4w+G组与H4w组间差异无显著性(P 0.05)。结论:葛根素有抑制慢性低O2高CO2肺动脉高压和肺血管重建的作用，促进PASMCs通过线粒体途径凋亡可能是其作用机制之一。 【关键词】 低氧 慢性 高血压 肺性 线粒体 凋 Effects of Puerarin on mitochondrial-dependent apoptosis pathway in pulomnary hypertension induced by hypoxic hypercapnia DING Cheng,WANG Liang-xing,CHEN Shao-xian,HUANG Xiao-ying. Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325000 Abstract: Objective: To study the effects of puerarin on mitochondrial-dependent apoptosis pathway in pulomnary hypertension induced by hypoxic hypercapnia. Methods: Fourty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: normal control group(N)，hypoxic hypercapnic 2 weeks group (H2w)，hypoxic hypercapnic 4 weeks group (H4w) and hypoxic hypercapnic 4 weeks + Puerarin group (H4w+G). The apoptsis of PASMCs was tested with TUNEL. The release of Cyt-c from mitochondria and the content of Bcl-2 and Bax in cytoplasm were determined with immunohistochemistry. The activity of caspase 9 was detected with spectropho-tometric method. Results: The mPAP, RV/(LV+S), PAMT and the content of Bcl-2 of PASMCs of group H2w， group H4w and group H4w+G were significantly higher than those of group N (P 0.01). The release of Cyt-c，the content of Bax of PASMCs and the activity of caspase 9 of lung in group H2w, group H4w and group H4w+G were significantly lower than those in group N (P 0.01). The apoptotic index of PASMCs in group H2w，group H4w and pulmonary elastic artery and pulmonary arteroles of group H4w+G were significantly lower than those in group N(P 0.01). The mPAP，RV/(LV+S)，PAMT and the content of Bcl-2 in pulmonary elastic artery and arteroles of group H4w+G were significantly lower than those of group H4w (P 0.01). The release of Cyt-c， the apoptotic index of PASMCs in pulmonary elastic artery and pulmonary muscular artery and the activity of caspase 9 of lung in group H4w+G were significantly higher than those in group H4w (P 0.01).Difference of content of Bax between group H4w+G and group H4w was not significant (P 0.05). Conclusion: Puerarin can lower pulmonary hypertension and inhibit structural remodeling of pulmonary arteries. Facilitating mitochondrial-dependent apoptosis of PASMCs may be one of the mechanisms of this action. Key words: hypoxia，chronic;hypertension，pulmonary;mitochondria;apoptosis;Puerarin 低氧性肺血管重建中各种类型细胞凋亡减少而增殖增加1。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary ar-tery smooth muscle cells，PASMCs)是肺血管壁的主要组成部分，增加PASMCs凋亡可以逆转肺动脉高压肺血管重建2。细胞色素C(cytochrome C，Cyt-c) 从线粒体中释放是细胞线粒体途径凋亡的关键步骤3,4。线粒体Cyt-c的释放受到Bcl-2蛋白家族的调控，Bcl-2和Bax蛋白是该家族中具有代表性的蛋白，分别起到抑制和促进凋亡的作用5,6。葛根素(Puerarin)是豆科植物野葛干燥根中的主要有效成分,大量研究发现，葛根素能促进主动脉平滑肌细胞的凋亡7。本实验拟通过研究葛根素对PASMCs线粒体Cyt-c释放、caspase 9活性以及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，探讨葛根素促进PASMCs线粒体途径凋亡是否为其抑制肺动脉高压肺血管重建的作用机制。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体重180210 g，由温州医学院实验动物中心提供。 1.1.2 试剂：In Situ Cell Death Detection Kit(德国Roche公司产品)，Bcl-2、Bax兔抗大鼠多克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)，Cyt-c兔抗大鼠多克隆抗体(美国Cell Signaling公司产品)，ImmPRESS REAGENT Anti-Rabbit Ig多聚过氧化酶二抗(加拿大Vector Laboratories 公司产品)，caspase 9活性检测试剂盒。Bradford蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所产品)。其余均为市售分析纯。 1.2 方法 1.2.1 动物模型制备：大鼠40只，随机分为对照组(N组)、慢性低O2高CO2 2周组(H2w组)、慢性低O2高CO2 4周组(H4w组)、慢性低O2高CO2 4周+葛根素组(H4w+G组)，每组10只。H2w组、H4w组置于常压低O2高CO2舱内，充入N2使O2浓度维持在8.5%11%，CO2浓度维持在5.0%6.5%。每天8 h，每周6 d，连续2周(H2w组)或4周(H4w组)。H4w+G组每次低O2高CO2前1/2 h腹腔注射葛根素(50 mg/kg体重，郑州羚锐制药有限公司产品，生产批号：0601022)，其条件同H4w组。N组置同室正常氧浓度环境饲养。 1.2.2 大鼠平均肺动脉压力(mPAP)、平均颈动脉压力(mCAP)及右心室重量比(RV/(LV+S)%)、中膜厚度(PAMT)的测定：采用右心导管法8测量、计算mPAP，颈总动脉插管测mCAP。分离右心室(RV)和左心室(LV)+室间隔(S)，滤纸吸水分后分别称重，计算两者的比值RV/(LV+S)。 每只大鼠取1张肺组织HE染色切片，每张切片随机选取不同直径(20200) m肺动脉各6支，Image-ProPlus 6.0软件测定肺肌型动脉和肺弹力型动脉内中膜厚度(PAMT)。 1.2.3 TUNEL法检测PASMCs凋亡：每只大鼠取1张肺组织石蜡切片，脱蜡水化后蛋白酶K(20 g/mg)37 消化30 min;3% H2O2溶液灭活过氧化酶;加TUNEL restion mixture 50 l/片，37 反应60 min;加 Convert-POD 37 反应30 min;DAB显色;苏木素复染。每张切片选取不同直径肺动脉各2只，使用Image-Pro Plus 6.0计数，凋亡指数(AI)=中膜阳性细胞核数/中膜总细胞核数。 1.2.4 免疫组化法测定PASMCs胞浆线粒体Cyt-c释放、Bcl-2、Bax含量：石蜡切片脱蜡水化;高压修复;3% H2O2溶液灭活过氧化酶;20%马血清室温封闭;加一抗稀释液(Cyt-c多克隆抗体1：25， Bcl-2多克隆抗体1：200，Bax多克隆抗体1：200)37 孵育60 min;多聚过氧化酶二抗室温孵育30 min;DAB显色，苏木素复染。Image-Pro Plus 6.0软件测定肺动脉平滑肌层平均光密度。 1.2.5 分光光度法检测肺组织匀浆caspase 9活性：按照说明书操作，根据设立的标准曲线测定酶活力(1个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37 可以剪切1nmol Ac-LEHD-pNA产生1nmol pNA的caspase 9的酶量)。 1.3 统计学处理方法 多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验。 2 结果 2.1 各组mPAP、mCAP、RV/(LV+S)和PAMT的比较 H2w组、H4w组和H4w+G组的mPAP、RV/(LV+S)、PAMT均显著高于N组(P 0.01)，H4w+G组的mPAP、RV/(LV+S)、PAMT均显著低于H4w组(P 0.01);四组间mCAP差异无显著性(P 0.05),见表1。 2.2 各组PASMCs的凋亡指数(AI)、线粒体Cyt-c释放量比较 H2w组和H4w组各级肺动脉PASMCs以及H4w+G组肺弹力型动脉、肺微细动脉PASMCs凋亡指数较N组显著下降(P 0.01);三组各级肺动脉PASMCs Cyt-c释放量显著低于N组(P 0.01)。H4w+G组肺弹力型动脉、肌型动脉PASMCs凋亡指数较H4w组相应直径肺动脉显著升高(P 0.05);其各级肺动脉PASMCs Cyt-c释放量显著高于H4w组(P 0.01)。见表 2、图 14。 2.3 各组PASMCs胞浆Bcl-2、Bax含量比较 H2w组、H4w和H4w+G组大鼠各级PASMCs Bcl-2含量显著高于N组(P 0.01)，见图57;Bax含量显著低于N组(P 0.01);H4w+G组肺弹力型动脉和肺微细动脉PASMCs Bcl-2含量显著低于H4w组(P 0.01)，见图58;Bax含量在两组间差异无显著性(P 0.05)。见表3。 2.4 各组大鼠肺组织匀浆caspase 9酶活性比较 H2w组(49.57 4.52)、H4w组(34.98 4.29)和H4w+G组(55.36 4.65)大鼠肺组织匀浆caspase 9酶活性显著低于N组(84.33 4.47)(P 0.01,F =11.54);H4w+G组肺组织匀浆caspase 9酶活性显著高于H4w组(P 0.01)。 3 讨论 肺血管重建被认为是慢性低O2高CO2所致肺动脉高压的主要病理变化9，主要表现为无平滑肌的肺泡动脉出现肌化，不完整的肌层趋于完整，肺小动脉和微动脉中膜PASMCs肥大和增生，管壁增厚，细胞间质增多，中膜增厚;外膜成纤维细胞增生，合成和分泌细胞外基质增加，并部分转型为肌纤维母细胞，迁移入中膜和内膜。在上述病理过程中，PASMCs凋亡减少1,10。本研究通过TUNEL法发现低O2高CO2肺动脉高压大鼠模型各级PASMCs凋亡减少，尤其以肺弹力型动脉和肺微细动脉最为显著，说明凋亡减少导致PASMCs数量增加是血管重构的重要原因。 Cyt-c是一种水溶性蛋白质，由核基因编码。正常情况下Cyt-c定位于线粒体膜间隙，不能通过外膜3。细胞凋亡信号引起Cyt-c通过线粒体PT孔(permeability transition pore)或Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道释放到细胞质中15，与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protease ac-tivating factor 1，Apaf-1) 结合形成多聚体，继而与caspase 9结合形成凋亡体(apoptosome)，激活caspase 9 及其下游的caspase,从而诱导细胞凋亡4。根据Alessandra等14的免疫组化方法，未经线粒体途径凋亡的细胞中，Cyt-c主要位于线粒体内(内外膜之间)，在胞质呈颗粒状分布，经线粒体途径凋亡的细胞，Cyt-c释放至胞浆，分布呈弥散性，单个细胞表现为对应抗原染色后光密度下降，相应区域内随着线粒体途径凋亡细胞个数的增加，平均光密度下降。本实验中Cyt-c的释放在模型组PASMCs明显减少，胞质线粒体绝大部分以颗粒状存在，说明线粒体膜完整性升高，抗凋亡能力增强，这一现象在肺微细动脉尤为明显，与慢性低O2高CO2肺动脉高压发病机制中肺微细动脉肌化的表现相符。肺匀浆caspase 9酶活性降低支持上述结果。根据实验结果，线粒体途径凋亡减少，参与了肺动脉