张老师 环境微生物实验大纲.doc

实验一 脱色培养基的配制及脱色微生物的分离一、目的要求1、掌握培养基配制的一般步骤；（参考实验指导书p45页）2、掌握高压蒸汽灭菌锅的使用方法；（参考实验指导书p54页）3、熟练平板制备技术及涂布技术；4、了解土样采集过程的注意事项；5、了解脱色微生物分离的一般原理；二、操作步骤（1）脱色培养基的制备（以下为每组步骤，共10组）脱色培养基：葡萄糖 1%, KH2PO4 0.1%, (NH4)2SO4 0.1%, MgSO4 0.05%, 酵母粉 0.02%，染料 100 mg.l-1（母液浓度1000 mg.l-1），固体加琼脂3.0%每组配制：固体培养基300ml，液体培养基200ml，按要求分装于试管中。（6支含染料的试管；16支不含染料的试管，备用）三角瓶用棉塞封口（皮筋绷口），试管用硅胶塞封口。 流程：称量溶解（加琼脂）调pH定容分装（2） 湿热高压灭菌 121，从气压到达时计时20min。灭菌时注意安全：气压计归零10分钟后方可打开螺丝，取出灭菌物品。灭菌完毕后在超净工作台中进行倒平板。流程：加水放物品通电源放气升温灭菌关电源降压取物品（3） 土样处理取25g 土样溶于10ml 蒸馏水，混匀后静置待分离。取适量悬液在超净工作台中涂布平板，培养。实验二 脱色微生物的筛选及微生物菌落形态结构观察一、目的要求1、 掌握微生物无菌操作技术；（参考实验指导书p59页）2、 掌握超净工作台的正确使用方法；（参考实验指导书p60页）3、 掌握光学显微镜的正确使用方法；（参考实验指导书p1页）4、 了解四大类微生物菌落形态的简单识别及描述；（参考实验指导书p74页）二、操作步骤 （1）普通光学显微镜的正确使用领取显微镜调节光源低倍镜观察高倍镜观察显微镜复原 （2）超净工作台的使用清洁台面提前30min打开超净工作台无菌操作操作后处理 （3）微生物菌落形态识别细菌：表面湿润，小而薄；酵母菌：表面湿润，大而厚；放线菌：表面干燥，小而致密；霉菌：表面干燥，大而蓬松； （4）脱色微生物的筛选 将在平板上长出的菌落转接于液体培养基中（每人一支），一组中的6位同学尽量转接外观差别比较大的菌株，以保证微生物种类的多样性；试管置于摇床中培养待用。三、注意事项 1、显微镜使用前后要做好实验记录，有问题要及时向老师反馈，责任落实到每个小组长。 2、镜检标本时，要先用低倍镜，而不能直接使用高倍镜或油境。 3、菌株转接时要注意无菌操作。 实验三 微生物染色技术及微生物细胞形态观察一、目的要求1、 掌握微生物接种技术；（参考实验指导书p62页）2、 巩固超净工作台及显微镜的正确使用方法；（参考实验指导书p60页）3、 掌握微生物染色的原理与技术；（参考实验指导书p16页）4、 比较不同菌株对同种染料的脱色效果；（参考实验指导书p74页）二、操作步骤 （1）微生物染色技术（绘制微生物细胞形态）A 细菌的简单染色步骤 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检B 放线菌及霉菌的观察 # 直接观察法 # 印片染色法 （2）微生物接种技术掌握从液体到液体的接种技术 （3）脱色微生物的选育（注意拍照） 每组选择选择一株脱色效果最好的微生物分别接种于16支含不同染料的试管中，置于摇床中培养，观察菌株对不同染料的脱色谱。 实验四 微生物脱色性能的测定及微生物的纯种分离技术一、目的要求1、 掌握微生物的纯种分离技术；（参考实验指导书p70页）2、 巩固超净工作台及正确使用方法及接种技术； 3、 比较脱色菌株对不同种染料的脱色效果，并记录；4、 掌握分光光度计的使用方法，测定培养基色度变化；二、操作步骤 （1）微生物纯种分离技术 倒平板 划线分离 （2）脱色性能测定（注意拍照） 比较菌株对16种染料的脱色效果，并利用分光光度计测定色度变化； （3）脱色菌株的扩大培养 将试管中的菌种无菌转接入三角瓶中，进行扩大培养； 实验五 微生物脱色性能测定（续）及微生物的菌种保藏技术一、目的要求1、 掌握微生物的斜面低温保藏技术；（参考实验指导书p77页）2、 巩固超净工作台及正确使用方法及接种技术； 3、 观察脱色菌株在扩大培养后的脱色效果，并记录相关现象；4、 测定脱色菌株在脱色前后染料培养基COD的变化；二、操作步骤 （1）微生物斜面低温保藏技术 取出上次纯种分离的平板，观察分离出的单菌落的菌落特征，并描述；然后将纯化后的菌落转接到试管斜面中进行划线，低温保藏。 （2）脱色现象观察（注意拍照） 观察三角瓶中培养基的脱色效果，并描述菌丝球的主要特征（大小、絮凝情况，菌丝球是否有颜色、生物量的多少等） （3）脱色前后COD值的变化 测定脱色前后COD的变化，巩固COD的测定方法；注意事项：1、 本大纲只是简单介绍整个实验流程，大家在撰写实验报告的时候要根据试验指导书将整个实验过程的详细步骤写清楚；2、 要求大家一定要做好课前预习；3、 要详细记录实验结果，并作出简单的试验现象分析；4、 分离的平板以及脱色效果等实验现象都要有拍照；5、 实验过程实行组长负责制，实验介绍后组长要负责撰写一份实验报告的电子文档（含实验照片）上交给指导老师。附：COD测定方法 化学需氧量COD的测定一：实验原理在强酸性溶液中，准确加入过量的重铬酸钾标准溶液，在消解罐中消解后，将水样中还原性物质（主要有机物）氧化，过量的重铬酸钾以是亚铁灵作指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液回滴，根据所消耗的重铬酸钾标准溶液量计算水样化学需氧量。本实验测COD浓度在50-1000mg/L.。二：实验药品 1：重铬酸钾标准溶液（1/6 K2Cr2O7 =0.200mol/L）,称取9.80g分析纯重铬酸钾于1000ml烧杯中，溶解大约500ml蒸馏水中，在搅拌中徐徐加入250mL的浓硫酸， 浓度为0.200mol/L2：掩蔽剂：硫酸汞（Hg2SO4）结晶或粉末3：催化剂 称取2g硫酸银（Ag2SO4）溶解于200ml浓硫酸中，摇匀。4：亚铁灵作指示剂 称取1.485g邻菲罗啉和0.695g硫酸亚铁(FeSO47H2O)溶于蒸馏水中，稀释至100ml存于棕色瓶内。5：硫酸亚铁铵标准溶液（NH4）2SO4FeSO46H2O0.05mol/L) 称取19.8分析纯硫酸亚铁铵溶于蒸馏水中，边搅拌便缓慢加入20ml浓硫酸，冷却后移入1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至标准线，摇匀。临用前用重铬酸钾标准液标定。标定方法：准确吸取10.00ml重铬酸钾标准溶液于150ml锥形瓶中，加蒸馏水稀释至20ml左右，缓慢加入5ml浓硫酸，摇匀，冷却后加入2滴亚铁灵作指示剂用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点。C (NH4）2SO4FeSO4= 0.200*10.00V式中C-硫酸亚铁铵标准溶液浓度mol/L V-硫酸亚铁铵标准溶液的用量mL三 实验仪器 1消解炉和消解罐 2：50ml酸式滴定管，锥形瓶，容量瓶，移液管等四 测试步骤1. 准去吸取均匀水样5.00 mL（每批水样在测试的同时需做两个空白）于消解罐中，加入1 g 掩蔽剂（不含氯离子的水样可不加），充分摇匀是Cl 与Hg+ 完全结合（若掩蔽剂很快全被溶解，则Cl的含量过高需不加掩蔽剂，直至仍有掩蔽剂不溶解为止），5.00 mL消解液，5.00 mL催化剂摇匀 。2. 旋紧密封盖，依次将消解罐均匀的放入装置炉腔玻璃转盘周边，关好炉门 。3. 按消解罐标准方法对样品进行消解。4. 消解完毕，打开炉门待其冷却后将消解罐从炉中取出，待罐内液体冷却至室温时（如需速冷可竖放入冷水盆中），用滴定法测出CODCr值 。五：测定方法1. 将样液移到150mL锥形瓶中，用20mL 蒸馏水分三次冲洗消解罐及盖的内 壁，冲洗液并入锥形瓶中，加入23滴试亚铁灵指示剂用硫酸亚铁铵标准溶液回滴，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量，按下式算出CODCr 。2. 计算方法 CODCr（mg/L）=式中：V0-空白消耗硫酸亚铁铵标准溶液用量（mL） V1-水样消耗硫酸亚铁铵标准溶液用量（mL） C-硫酸亚铁铵标准溶液浓度（mol/L） 8-氧（1/2 O）摩尔质量（g/mol） V2-水样体积（mL）实验一染料脱色试验1目的 1.1了解微生物分离和纯化的原理 。1.2掌握常用的分离纯化微生物的方法 。2原理 平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化.本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用选择培养基从土壤中分离出所需的微生物，本实验主要从土壤中分离出真菌并进行下一步实验。3材料 3.1培养基：脱色培养基：葡萄糖 1%, KH2PO4 0.1%, (NH4)2SO4 0.1%, MgSO4 0.05%, 酵母粉 0.02%，染料 100 mg/L（母液浓度2000 mg/L），固体加琼脂2.0%3.2 仪器或其它用具 :无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，试管，无菌培养皿，土样（每组取两种），培养基配置：每组配置固体培养基300ml，液体培养基100ml4 流程 制备土壤悬浮液涂布（或划线法）培养挑单菌落液体培养基进行筛选保存。5 步骤 5.1 制备土壤样品 称取5g土壤样品放入离心管中，用量筒量取10ml自来水倒入离心管中振荡均匀。静置二十分钟至澄清。5.2 涂布用移液管移取0.1ml或0.2ml土壤上清液小心地滴在平板培养基表面的中央位置。右手拿无菌涂