引物合成步骤.doc

引物化学合成不同于酶促的DNA合成过程从53方向延伸，而是由3端开始。具体的反应步骤如下： 一、脱保护基(Deblocking)用三氯乙酸(TrichloroaceticAcid，TCA)脱去连结在CPG(ControlledPoreGlass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5-羟基端，以供下一步缩合反应。 二、活化(Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3-端已被活化，但5-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 三、连接(Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 四、封闭(Capping)缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。 五、氧化(Oxidation)缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。固相合成Oligo是在DNA合成仪上进行的,上述方法合成的Oligo在脱去保护基后,目的Oligo纯度是极低的,含有大量的杂质,主要杂质有所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基以及合成时产生的短链等,以至于粗产品中Oligo含量仅为15%左右。尽管合成时每一步的效率都在97%98%,但累积的效率并不高。以链长20mer和50mer为例，(97.5%)2060%、(97.5%)5028%,可见在粗产品中目的Oligo含量很低，甚至10%都不到。这些杂质,尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链,不但造成定量不准,影响下一步的反应,因此必须对Oligo进行纯化。建议采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化,该方法纯化的产品纯度高,可用于绝大部份的分子生物学实验,可避免许多意想不到的麻烦。若考虑节约经费,对于要求较低的实验,如简单的PCR反应,则采用脱盐纯化即可。OligoDNA是以OD260值来计量的。在1ml的1cm光程标准石英比色皿中,260nm波长下吸光度为1的Oligo溶液定义为1OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说,其碱基的组成不尽相同,但1260ODOligoDNA的重量约为33mg，每个碱基的平均分子量约为330Da。 以下是合成简图： 感悟与讨论：1：在合成修饰碱基时，在固相化学合成法中合成的方向是从3端向5端进行，注意修饰碱基的生物试剂的用量和反应时间。 2：注意碱基用于标记引物时会在链的两端标记生物素或者地高辛等，或标记荧光素这样有助于在做PCR时的成功率。 3：合成碱基时的试剂用量以及其浓度和温度、种类等方面对合成的目标引物有很大的影响，所以在合成时注意操作条件。 4 ：在进行HPLC纯化时注意出峰的峰形，分析并联用质谱来综合准确分析引物是否达到要求。实验结果: 经过以上合成以及纯化分析后客户所需求的目标产物得以完成，经测