细胞工程大实验.doc

仲恺农业工程学院课程学习报告课程名称：细胞工程大实验学期：2008-2009学年第一学期实验一 培养基母液和培养基的配制实验二 水稻及胡萝卜再生体系的建立实验三 悬浮细胞体系的建立实验四 植物遗传转化实验五 原生质体游离与培养实验六 植物快速繁殖实验七 玉米幼胚接种院 系： 生命科学学院 班 级： 姓 名： 学 号： 实验一 培养基母液和培养基的配制摘要为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。各种混合液（母液）或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。关键词 培养基母液、培养基、无机盐、有机物、激素、附加物前言本实验的目的是要学习并掌握培养基母液配制的方法和培养基配制的方法，掌握不同物质浓度按比列稀释和转化的计算方法。在配制培养基前，先配制单一化合物母液可以提高称量的准确性并减少多次称量的麻烦，配制多种培养基都需要的同一种母液，放置冰箱中保存，用时按比例稀释即可。培养基实际一是一个人工模拟的植物生长、发育环境，在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养万分生长因子、理化环境等主要同培养基提供。不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。另外，组织培养物的脱分化、分化等状态的调控，次生代谢物的产出等都要通过调节培养基成分来实现。一 材料与方法步骤 （一）试剂 培养基母液（以MS为例）：NH4NO3；KNO3 ；CaCl2.2H2O；MgSO4.7H2O；KH2PO4；(NH4)2SO4；H3BO3；KI；MnSO4.H2O；ZnSO4.7H2O；NaMoO4.2H2O；CuSO4.5H2O；CoCl2.6H2O；Na2EDTA.2H2O；FeSO4. 7H2O；甘氨酸；盐酸吡哆醇；盐酸硫氨素；烟酸；肌醇；2，4D；6BA；NAA培养基：1N HCl ；1N KOH； 标准pH溶液（25下，pH4.01和pH6.08的标准溶液各100ml）；蔗糖；琼脂；水解蛋白酶；谷氨酰胺；脯氨酸。（二）方法步骤1、培养基母液配制(1) 大量元素母液大量元素母液含N、P、K、Ca、Mg、S等六种盐类的混合溶液，可配置10倍或20倍的母液，使用时每配置1000ml培养基时取100ml或50ml母液。 表1 MS培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度（mg/L）扩大10称量(mg)备注1NH4NO3165016500蒸馏水定容至1000ml2KNO31900190003CaCl22H2O44044004MgSO47H2O37037005KH2PO417017001 将1升培养基所需各种微量元素扩大10倍，进行实际称量。分别称取上述药品：16.5g，19g，4.4g，3.7g，1.7g。2 将混合液倒入1000ml量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4储存。（2）微量元素母液1 按培养基配方所列元素成分，取相应分析纯化学试剂（对水合分子不同的试剂要进行换算）。例如换算MnSO44H2O：MnSO44H2O分子质量/ MnSO47H2O分子质量，再乘以11.15g。2 将1升培养基所需各种微量元素扩大1000倍，进行实际称量。分别称取上述药品：8.45g，4.3g，3.1g，0.425g，0.125g，0.0125g，0.0125g。3 将混合液倒入500ml量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4储存。表2 MS培养基微量元素的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大1000倍称量(mg)备注1MnSO44H2O22.322300蒸馏水定容至500ml2ZnSO47H2O8.686003H3BO36.262004KI0.838305Na2MoO42H2O0.252506CuSO45H2O0.025257CoCl26H2O0.02525（3）铁盐母液铁盐与其他无机成分混合易产生沉淀，须单独配制。通常采用硫酸亚铁和Na2-EDTA混合物，以形成络合物，提高铁盐的利用率。铁盐一般配成100倍的螯合铁盐母液，使用时每配置1000ml培养基取10ml。表3 MS铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍称量(mg)备注1Na2-EDTA 3.73373蒸馏水定容至100ml2FeSO47H2O2.78278分别称取药品：0.373g，0.278g，置于烧杯中，在沸水浴中加热搅拌20-30min，当出现金黄色时拿出来，调PH至5.5，冷却后倒入棕色瓶保藏。（4）有机成分母液有机化合物母液原则上应分别单独配制，实际使用时，往往配制成除肌醇外其他有机成分的混合液，一般配置成100倍或1000倍母液，使用时每配置1000ml培养基取10ml或1ml。表3 MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍称量(mg)备注1甘氨酸2200蒸馏水定容至1000ml2盐酸硫胺素(VB1)0.4403盐酸吡哆素(VB6)0.5504烟酸0.5505肌醇10010000单独配制（5）激素母液激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg/ml到1.0mg/ml不等。1 2，4D母液（20 mg100 ml）：用万分之一天平称取2，4-D 20 mg 用少量95%乙醇充分溶解 加水定容为100 ml。2 6BA 母液（20 mg100 ml）：用万分之一天平称取6BA 20 mg 用少量1N HCl充分溶解 加水定容为100 ml。3 NAA母液（20mg100 ml）：用万分之一天平称取NAA 20 mg 用少量95%乙醇充分溶解 加水定容为100 ml。2、培养基的配制（300ml）B5培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe盐）+0.5mg/L 2，4-D+7g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，PH=5.8N6培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe盐）+0.5mg/L 2，4-D+水解蛋白酶500mg/L+谷氨酰胺700mg/L+脯氨酸700mg/L+7g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，PH=5.8(1) 混合培养基中的各成分（取母液）：200ml烧杯一只，用50ml量筒量取大量元素20ml（10X），再用移液管分别吸取微量元素2ml（100X），铁盐2ml（100X），有机成分2ml（100X）肌醇2ml（100X）和激素类（浓度临时确定），最后用蒸馏水定容至所需配制的培养基体积的一半。 (2) 溶化琼脂：称取应加的琼脂和蔗糖，加蒸馏水至所需配制的培养基体积的一半，在壁上做一液面记号，放置约0.5-1h，待蔗糖溶解，琼脂发胀后，加热烧开溶化琼脂。若失水，则加蒸馏水至液面记号处。 (3) 混合：把1和2混合在一起，搅匀。(4) pH值：培养基的pH值会影响植物对养分的吸收与利用，还会影响琼脂等固化剂量的凝固，因此培养基必须调至一定的pH值。用pH计或pH试纸测pH值，并用1N的NaOH或HCl调至pH为5.8。不同植物培养所要求的pH值有所不同。此外，培养基经高压灭菌后pH值一般要降低0.10.2，所以在灭菌前调pH值时要相应提高。 (5) 分装：用玻璃漏斗将配好的培养基分装于10个三角瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口或内外壁上，以防引起污染，然后用棉塞或硫酸纸封好瓶口。写明培养基代号，日期，实验人等，扎好线绳。3、培养基的灭菌培养基必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，从而导致培养外植体死亡。本实验采用高压蒸汽灭菌法。二 结果讨论 微量元素是培养基不可缺少的部分。由于较难称取，所以每次实验应首先拟好实验大纲，配置好母液，这能够使实验的进度简便快捷。实验中的培养基的配比不是绝对的，我们应根据实际情况对其进行改变。并尝试用不同的培养基培养同一外植体，通过结果寻找实验的改进。实验二 水稻及胡萝卜再生系的建立摘要以胡萝卜块根及水稻种子为材料诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转入分化培养基进行培养。结果表明，在试用的培养基中以2，4-D浓度为01mgL时愈伤组织状态为最佳；愈伤组织的诱导宜在黑暗条件下；培养基种类时愈伤组织的分化率影响不大，且主要以胚状体形式出芽。组织培养的物的脱分化、生长及分化均是基因选择地表达和关闭地结果，作为第一信使的植物激素在这些过程中是信号传导地发起者。因此，培养物地生长、分化方向地控制主要是通过添加不同种类和浓度的植物激素来实现的。由外植体诱导愈伤组织是一个脱分化的过程，通常需要加入较高比例的生长类激素，如2，4D。关键词 水稻；胡萝卜；愈伤组织；继代前言在一定的培养条件下，愈伤组织通过器官发生途径形成芽或根的分生组织，继而发育成完整的植株，或通过体细胞胚胎发生途径形成胚状体，继而发育成完整的植株。由愈伤组织再生植株是一个再分化过程。一般而言，高比例的细胞分裂素/生长素有利于芽的形成；低比例时有利于根的形成。再生植株移至生根培养基上可以生根，生根的小苗经过练苗后可移栽室外培育。本实验的目的是学习利用外植体诱导形成愈伤组织的方法，了解其诱导继继代培养的过程。一 材料与方法1.1植物材料 胡萝卜块根 水稻种子 水稻愈伤组织1.2方法1.2.1愈伤组织诱导1）外植体的消毒胡萝卜：将胡萝卜块洗净，削皮、切除两端、切成小块，75%酒精浸泡3分钟，倒掉酒精，无菌水洗1次，用1%HgCl2消毒12分钟，在用无菌水洗34次。水稻：挑选约100粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水洗34次2）接种胡萝卜愈伤组织诱导培养基为：B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 2，4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8；B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 6-BA0.2mg/l+ 2,4-D0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8；MS(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒后的胡萝卜切除两端和外层部分，切成0.51mm左右的小圆片，切下形成层部分，并切成长2mm宽1.5的小长块，接种于诱导培养基上（三角瓶和平板培养基），25暗培养。水稻愈伤组织诱导培养基为：N6(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D2mg/L+水解酪蛋白500mg/L脯蛋白700mg/L+谷氨酰氨700mg/L蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒的种子接种在上述培养基中（三角瓶和平板），25暗培养。1.2.2愈伤组织的继代将无菌的水稻愈伤组织接种在MS(大量,微量,有机,肌醇,铁盐)+水解蛋白酶300mg/L+6-BA3mg/L + NAA 1mg/L +蔗糖（30g/L）+琼脂7g ，PH 5.8的培养基中（平板和三角瓶），25光培养。1.2.3愈伤组织的分化取上述三角瓶继代培养的水稻愈伤组织继续在25下光培养。二 结果与分析实验三 悬浮细胞体系的建立摘要本实验从建立稳定的水稻悬浮细胞系开始，将悬浮细胞分别转入分化培养基进行培养，水稻愈伤组织分化的培养基是N6。植物细胞悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中于摇床上进行培养增殖的无菌培养技术，在培养过程中能够保持良好的分散状态。目前这项技术已广泛用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。关键词愈伤组织 悬浮细胞系 继代 分化前言一个成功的悬浮细胞系必须具备以下条件：（1）悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30-50个细胞下，在实际培养中很少有由单细胞组成的植物细胞悬浮系。（2）均一性好，细胞形状和细胞大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色彩呈鲜艳的乳白或蛋黄色。（3）细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般为2-3天或更短时间内细胞数量更加一倍。使悬浮系分散的基本方法有：（1）选择松散易碎的愈伤组织进入悬浮培养。（2）高auxin/cytokinin的比例，或完全去除cytokinin。（3）使用更强的auxin，如将IAA改为NAA，NAA改为2，4-D。（4）加少量的cellulase(0.1%)/pectinase(0.05%).（5）粗研愈伤组织使之成为较小的细胞团再进行悬浮培养。（6）固-液反复交替培养。（7）选择继代。本实验的目的是了解植物悬浮细胞培养过程，掌握悬浮细胞系建立和继代保持的方法。一 材料与方法1.1实验材料 水稻种子 水稻愈伤组织1.2方法1.2.1水稻愈伤组织诱导1）外植体的消毒挑选约100粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水洗34次2）接种水稻愈伤组织诱导培养基为：N6(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D2mg/L+水解酪蛋白500mg/L脯蛋白700mg/L+谷氨酰氨700mg/L蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒的种子接种在上述培养基中（三角瓶和平板），25暗培养。1.2.2愈伤组织的继代将无菌的水稻愈伤组织接种在MS(大量,微量,有机,肌醇,铁盐)+水解蛋白酶300mg/L+6-BA3mg/L + NAA 1mg/L +蔗糖（30g/L）+琼脂7g ，PH 5.8的培养基中（平板和三角瓶），25光培养。1.2.3愈伤组织的分化取上述三角瓶继代培养的水稻愈伤组织继续在25下光培养。1.2.4水稻悬浮体系的建立1）培养基（1）MS + 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（2）N6+ 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（3）MB + 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（4）NB+ 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8。2）接种挑选疏松，生长旺盛的水稻愈伤组织12g放入盛有30ml液体培养基的100mL三角瓶中；用镊子轻轻捏碎愈伤，增加细胞的分散程度；把培养基放入温度为25的摇床中进行暗培养，转速为160r/min，观察悬浮细胞系的生长状态。1.3.2水稻悬浮体系的继代培养一段时间后，待有新的愈伤组织长出，在无菌工作台上将各种培养基倒掉一半，用镊子夹除较大块的愈伤组织，分别加入各种新的培养基，用锡箔纸盖好，继续放入温度为25的摇床中进行暗培养，转速为160r/min，观察悬浮细胞系的生长状态。二 结果与分析实验四 植物遗传转化摘要水稻作为单子叶植物遗传研究的模式植物,具有许多优势,同时作为重要的粮食作物,研究水稻胚胎发生过程的基因表达变化具有重大的理论和实际意义。目前通过遗传转化技术获得了许多植物的转基因植株，一些重要农作物转基因新品种已进入产业化阶段，展现出极好的应用前景。本实验依据T-DNA能自由转移的特征采用农杆菌介导法来将外源基因导入水稻愈伤细胞，再继续进行愈伤组织培养，实验水稻的遗传转化。关键词水稻 农杆菌 介导法 遗传转化 Ti质粒前言农杆菌介导法相对于其他转化法而言，具有明显的优点：农杆菌介导水稻转化时，外源基因多以单拷贝或低拷贝数插入，并优先插入转录活性区域，因较少出现基因沉默现象；转化效率高，双子叶植物可达80%-90%，单子叶如水稻也可达20%-30%，这可能与T-DNA链在转移过程中受到蛋白质（VirE2、VirD2）的保护及其定向作用，不易被细胞内核酸酶降解有关；T-DNA具有左右边界，转移的是位于左右边界的外源片段，故导入细胞的目的片断明确；可以转移大片断DNA，并可以稳定整合到基因组中；转化植株通常可育，大多数呈孟德尔式遗传；方法简单、有效；转基因植株很少出现形态变异。影响根瘤农杆菌介导植物转化的因素很多，主要影响因素有：植物品种；农杆菌侵染的植物组织的生理状态的选材；培养基的组成成分；农杆菌菌株和载体；转化体的筛选；启动子；其他处理的影响等。本实验的目的是为了了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握农杆菌介导植物遗传转化的基本操作技术。一 材料与方法1.1植物材料 水稻愈伤组织（水稻种子）1.2方法1.2.1水稻愈伤组织的诱导-1）外植体的消毒挑选约100粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水洗34次2）接种水稻愈伤组织诱导培养基为：N6(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D2mg/L+水解酪蛋白500mg/L脯蛋白700mg/L+谷氨酰氨700mg/L蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒的种子接种在上述培养基中（三角瓶和平板），25暗培养。1.2.2水稻愈伤组织的继代将无菌的水稻愈伤组织接种在MS(大量,微量,有机,肌醇,铁盐)+水解蛋白酶300mg/L+6-BA3mg/L + NAA 1mg/L +蔗糖（30g/L）+琼脂7g ，PH 5.8的培养基中（平板和三角瓶），25光培养。1.2.3愈伤组织的筛选农杆菌悬浮培养基：MB+麦芽30g/L+水解酪蛋白500mg/L+肌醇2g/L+2,4-D2.0mg/L pH 5.5共培养培养基：MB+麦芽30g/L+水解酪蛋白500mg/L+肌醇2g/L+2,4-D2.0mg/L+琼脂粉7g/L，pH 5.5筛选培养基：NB+30g/L蔗糖+500mg/L谷氨酸钠+500mg/L脯氨酸+500mg/L水解酪蛋白+2,4-D2.5mg/L+琼脂粉8g/L+潮霉素500mg/L+羧卡青霉素250mg/L+头孢250mg/L，pH5.81）农杆菌的活化与涂板。 2）农杆菌的悬浮，刮下适量农杆菌放入农杆菌悬浮培养基中150rpm/min，振荡20min，使农杆菌完全悬浮，OD=0.1。 3）挑选生长状态好愈伤组织6080颗。 4) 农杆菌浸染愈伤组织，将农杆菌倒入装有愈伤组织的灭菌三角瓶，浸染20min。 5）倒掉悬浮液，将愈伤组织取出放在带滤纸的灭菌培养皿上吸干。 6）将愈伤组织接入共培养基上（培养基上放一张灭菌滤纸），25，暗培养35d。7）无菌水洗2次，然后用加250mg/L羧卡青霉素和250mg/L头孢的无菌水洗10次。8）取愈伤组织放入带滤纸的无菌培养皿，晾干，放在光下干燥1-2d。9）将愈伤组织放入筛选培养基进入筛选，抗性愈伤组织进行预分化和分化。二 结果与分析实验五 原生质体游离与培养摘要原生质体培养是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗，最终再生成完整植株。一般用酶解去壁法获得原生质体。本实验以菠菜叶和西洋菜叶进行原生质体游离，比较容易。关键词原生质体 游离 细胞密度 细胞计数前言植物原生质体是指除去细胞壁后被原生质膜所包围的“裸露细胞”，是开展细胞生物学基础研究和外源基因及细胞器导入的理想材料。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团、愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗，最终再生成完整植株。一般用酶解去壁法获得原生质体。细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和和果胶酶能降解细胞壁，获得原生质体。由于去除了细胞壁，原生质体对渗透压的改变非常敏感，故必须将其保持在等渗的溶液中，外界渗透压过高和过低都会导致细胞的破裂。细胞壁再生后应逐步降低渗透压，以利于细胞生长和增殖。本实验的目的是学习和掌握利用酶解法脱除植物细胞壁，获得原生质体的方法，和掌握原生质体培养的方法。一 材料与方法1.1植物材料 菠菜叶、西洋菜叶1.2方法1.2.1不同激素效果比较1）配制酶液纤维素酶1%，果胶酶0.1%，以cpw配制20mL，过滤灭菌 2）外植体灭菌取2种蔬菜叶各1g，分别进行灭菌（自来水冲洗干净，70%酒精灭菌30S，HgCl2灭菌10min，无菌水冲洗3次）3）原生质体分离 分别将2种蔬菜叶在带滤纸的培养皿上切碎（尽量小），加入10mL灭菌的酶液中，黑暗，70rpm震荡激素5-6h，镜检激素效果。1.2.2原生质体计算首先要将原生质体提纯：原生质体混合液过滤滤液离心，800rpm离心2min加入8mLcpw 垂悬原生质体800rpm离心2min，倒掉上清液加入8mLcpw 垂悬原生质体800rpm离心2min，倒掉上清液加入8mLcpw 垂悬原生质体800rpm离心2min，尽量去除上清液。加入200ul-1mL固体培养基垂悬原生质体原生质体计数，调整原生质体密度至105 。1.2.3原生质体培养培养基：MS+水解酪蛋白500mg/L +2,4-D2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+甘露醇30g/L，pH 5.6 常温下，暗培养二 结果与分析实验六 植物快速繁殖摘要本实验以优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞作为材料，利用离体培养技术，可在短时间内获得大量的植株，某种植物能否通过组织培养进行大量、快速繁殖，关键在于设计和选用合适的培养基，使每个分生组织细胞或脱分化的体细胞能够持续生长并适时分化。对于一些用种子繁殖有困难的植物品种，组织培养无疑是实现快速、大量繁殖的最佳选择。对石斛兰类原球茎进行分割，接种在添加不同浓度的6-BA、KT、NAA的MS培养基上，培养28d后，可观察到6-BA3mg/L、NAA1mg/L、KT1mg/L的组合为最佳组合。分别以菊花的茎段、叶柄、叶片为外植体，接种在MS培养基上，观察不同材料的效果。兰花的快速繁殖包括以下技术环节：建立无菌培养物，诱导原球茎，根状茎或不定芽的形成；培养物的大量增殖；植株分化；试管苗移植。关键词菊花 石斛兰 快速繁殖 组织培养 离体培养 增殖前言石斛兰具有较高的观赏和经济价值，但以往主要以分枝方法自然繁殖，繁殖系数低，且易带病；而以种子繁殖时，由于其胚为发育不完全的胚，并且没有胚乳，所以发芽率极低。植物组织培养技术的发展为石斛兰的快速繁殖带来了无限生机，并导致了六十年代以来的石斛兰工业的发展。迄今已有70个属几百种兰花可以用组织培养法进行繁殖。植物的快速繁殖包括以下技术环节：建立无菌培养物，诱导原球茎，根状茎或不定芽的形成；培养物的大量增殖；植株分化；试管苗移植。通过本实验，学习植物快速繁殖的方法。并要求学生自己设计实验，通过实验，了解在不同的NAA浓度下，石斛兰的生长状况，从而得出石斛兰所需NAA的最佳浓度。培养学生的创新精神和动手能力。一 材料与方法1.1植物材料：菊花植株（无菌） 石斛兰原球茎（无菌）1.2方法1.2.1石斛兰类原球茎增殖与分化不同浓度激素的培养比较1）培养基以MS为基本培养基，附加6-BA16mgL、NAA0.51mgL及KT1mgL，蔗糖30g/L,琼脂粉8g/L ，pH58。MS +6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+KT1mgL+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L pH58MS +6-BA5mg/L+NAA0.5mg/L+KT1mgL+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L pH58MS +6-BA2mg/L+NAA1mg/L+KT1mgL+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L pH58MS +6-BA5mg/L+NAA1mg/L+KT1mgL+蔗糖3