紫外风光光度法.doc

紫外吸收法测定核酸的含量小组成员： 班级：麻醉11-2班日期：2012年12月19一、试验 目的1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。2、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、 实验原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（CC一CC一），能够强烈吸收250280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以（）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。它们的经典数值（pH = 7.0）如下：DNA的（）= 6 000 8 000RNA的（）= 7 000 10 000 小牛胸腺DNA钠盐溶液（pH = 7.0）的（）= 6 600，DNA的含磷量为9.2%，含1g/mL DNA钠盐的溶液光密度为0.020。RNA溶液（pH = 7.0）的（）= 7 7007 800，RNA的含磷量为9.5%，含1g /mL RNA溶液的光密度为0.0220.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1g/mL的 DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1g/mL的RNA溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3gmL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40，这就是众所周知的增色效应（hyperchromic effect）。在大分子的核酸中，氢键和-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应（hypochromic effect）。蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的110或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值.在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法事先除去。三、实验材料、主要仪器和试剂（一）试剂1标准核酸溶液（酵母RNA或小牛胸腺DNA，用0.01NaOH溶液配制成500g/ml溶液）2待测核酸样品（二）器具1、紫外分光光度计2、微量注射器（50L）3、移液管3试剂（1）5%6%氨水：用25%30氨水稀释5倍。（2）钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。四、操作步骤（一）核酸紫外吸收光谱的测定取100L的RNA溶液于试管中，加入5 mL蒸馏水，摇匀，测定核酸溶液在220290nm波长范围的消光值，再用蒸馏水作空白调零。以该溶液在各波段的光吸收值（即A值）为纵坐标，波长为横坐标，绘制核酸的吸收光谱。（二）核酸溶液含量的测定将上述测吸收光谱溶液的A260直接计算溶液的RNA含量A260 五、实验结果DNA含量=0.024/0.020*5=5ug/ml六、注意事项 如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液A值作为对照。七、思考 1用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先