TNF-α对类风湿关节炎滑膜细胞中MAPK的作用.doc

TNF-对类风湿关节炎滑膜细胞中MAPK的作用TNF-对类风湿关节炎滑膜细胞中MAPK的作用2010-10-06 燕太强吕厚山药立波孙铁铮杨敏丁海明陈占昆蒋东芳 【摘要】目的观察TNF-作用于类风湿关节炎(RA)滑膜细胞后滑膜细胞中MAPK的激活。方法35代体外培养的RA滑膜细胞加外源性TNF-刺激后，裂解细胞，收获蛋白，进行Western blot分析。结果TNF-刺激后滑膜细胞中有多种蛋白发生酪氨酸磷酸化，其中以MAPK最明显，MAPK的激活呈时间和剂量相关。结论TNF-作用于RA滑膜细胞伴有明显的MAPK激活，MAPK可能是TNF-作用于RA滑膜细胞后信号传导中的重要介质。 【关键词】肿瘤坏死因子关节炎，类风湿滑膜成纤维细胞有丝分裂原蛋白激酶类 Tumor necrosis factor- induced activation and increased tyrosine phosphorylation of mitogen-activated protein (MAP) kinase in rheumatoid synovial fibroblasts YAN TaiqiangL HoushanYAO Libo,et al. (Arthritis Clinical and Research Center,Peoples Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100044) 【Abstract】ObjectiveTo determine whether TNF- activates MAPK in rheumatoid synovial fibroblasts.MethodsCultured rheumatoid synovial fibroblasts were stimulated with exogenous TNF-,and then Western blot analysis of cell lysates was made.ResultsMultiple protein kinases were phosphorylated upon TNF- treatment.Induction of MAPK phosphorylation was time-and dose-dependent.ConclusionMAPK is likely to represent an important component in the cascade of signals that link TNF receptors to various TNF- elicited cellular responses in rheumatoid synovial fibroblasts. 【Key words】Tumor necrosis factorArthritis,rheumatoidSynovial membraneFibroblastsMitogensProtein kinases RA的发病与关节液中异常增高的细胞因子和生长因子密切相关，TNF-是一种重要的炎性介质，RA关节液中TNF的水平远远高于骨关节炎和创伤性关节炎。高水平的因子持续刺激滑膜细胞，引起细胞内蛋白激酶的持续激活和过度的信号传导，从而调控相关基因的过量表达。体外实验证实TNF能上调RA滑膜细胞分泌IL-6、IL-8、胶原酶、基质金属蛋白酶、环氧化酶、细胞粘附分子和PGE2等。因此研究TNF-作用于RA滑膜细胞后的信号传导途径，不但有利于揭示RA的发病机制，还为治疗RA提供新的途径。但是，有关TNF-作用于RA滑膜细胞后细胞内信号传导途径以及相关信号传导分子的活性变化未见有报道。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1抗体：特异性单克隆抗磷酸酪氨酸抗体4G10(UBI，USA)、辣根过氧化物酶耦联羊抗鼠IgG，三种抗活化型MAPK(ERK、JNK、P38)多克隆抗体(Promega,USA)、三种抗非活化型MAPK(ERK、JNK、P38)多克隆抗体(Santa Coruz，USA)、辣根过氧化物酶耦联驴或羊抗兔IgG。 1.1.2主要试剂：DMEM培养基(Gibco公司产品)，灭活胎牛血清(北京北郊牛奶厂，北京医科大学监制)，胰蛋白酶，Tween-20，Tris，TNF-(5109 U/L，由第四军医大学惠赠)、牛血清白蛋白(BSA)、去污剂相容性蛋白定量试剂盒(Bio-Rad)、ECL Western blot发光试剂和胶片(Amersham公司产品)。 1.2方法 1.2.1RA滑膜细胞的体外培养：20例类风湿关节炎病人均符合1987年美国风湿病协会(ARA)诊断标准1。进行全膝关节置换或膝关节滑膜切除时，无菌获取滑膜组织，尽量剔除脂肪及纤维组织，PBS清选两遍，剪成约1 mm3的碎块，置于无菌瓶内，用0.5 g/L的胶原酶I消化45小时，200目纱网过滤后，离心2次，去除脂肪及杂质。加入DMEM培养液(含20%胎牛血清，20 mmol/L HEPES，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10万U/L青霉素，100 mg/L链霉素)，分装于培养瓶内，置于37 5% CO2孵箱内培养。第2天，滑膜细胞贴壁后，弃除非贴壁细胞，更换培养液，待滑膜细胞基本长满后，0.25%胰蛋白酶0.1% EDTA消化传代，实验用35代细胞。 1.2.2滑膜细胞的处理：将35代的滑膜细胞消化后，细胞悬液平均置于直径为60 mm的培养皿中，待细胞约90%长满时，吸除培养液，换用5 ml无血清DMEM培养液静息24小时，不同浓度TNF-刺激滑膜细胞不同时间后，预冷PBS冲洗3遍，加入单去污剂裂解液(50 mmol/L Tris*Cl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.02%叠氮纳，100 mg/L PMSF，5 mg/L Aprotinin，10 mmol/L矾酸钠，2 mmol/L EDTA，1% Triton X-100)100 l，置于冰盒上20分钟后，细胞刮仔细收集裂解的细胞，置于0.5 ml的EP管中，涡旋2次，置于冰中静止15分钟，离心15 000 r/min，10分钟，将上清移至新EP管中。 1.2.3蛋白浓度的测定：参照去污剂蛋白定量试剂盒的说明，首先绘制蛋白定量标准曲线。BSA(牛血清白蛋白)配成原液浓度为45 g/L，用上述单去污剂裂解液依次稀释为01.5 g/L的浓度梯度。12.5 l各浓度梯度标准液及10 l待测蛋白溶液，依次加入A液(A液S液)62.5 l，混匀后加入500 l B液，静止15分钟后，于分光光度计750 nm下测定A值。待测蛋白的浓度通过其A值定出蛋白浓度。 1.2.4Western blot分析：根据蛋白浓度，每条泳道上样25 g蛋白，加入等体积的1SDS凝胶加样缓冲液(50 mmol/L Tris*Cl pH 6.8，100 mmol/L 二硫苏糖醇，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油)，100 加热5分钟使样品中蛋白变性，30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将凝胶中蛋白电转移11.5小时至硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂奶粉封闭4 过夜或室温下2小时，PBS-T(PBS0.1% Tween-20)洗膜15分钟1，室温下于摇床上抗孵育23小时，PBS-T洗膜15分钟3，二抗孵育1