细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析.doc

细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析来源：中国论文下载中心 10-10-28 11:53:00 编辑：studa20 - 作者：胡耀华,钟文彬,周林,黄树林【摘要】 目的 建立高效毛细管电泳法测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的分析方法，测定细菌代谢产物中的小分子有机酸。方法 采用毛细管：Beckman coulter未涂层50 m60 cm (有效长度50 cm);缓冲溶液：pH 10.5的10 mmol/L(含0.5 mmol/L CTAB)的硼砂溶液;检测波长214 nm，分离电压-20 kV，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s。结果 4 min内甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸得到基线分离。线性范围分别为：甲酸3.830.7 mg/L (r=0.997 1);乙酸3.352.5 mg/L (r=0.996 1);丙酸3.149.5 mg/L (r=0.999 3);丁酸348 mg/L (r=0.992 5);乳酸7.560.5 mg/L (r=0.999 5)。平均回收率分别为: 甲酸99.29%(RSD=0.67%);乙酸98.90%(RSD=1.36%);丙酸99.65%(RSD=0.65%);丁酸99.35%(RSD=0.42%);乳酸98.06%(RSD=1.44%)。结论 该方法简单、快速、准确，可用于细菌发酵液中代谢产物有机酸的检测。 【关键词】 细菌代谢产物 小分子有机酸 高效毛细管电泳Abstract:Objective To establish a method for determining formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid in bacterial metabolites by the highperformance capillary electrophoresis. Methods Samples were analyzed on a Beckman Coulter (50 m 50 cm) uncoated fusedsilica capillary using 10 mmol/L borate buffer ( pH 10.5,containing 0.5 mmol/L CTAB). The UV detection wavelength was 214 nm,the separation voltage -20 kV and injection pressure 1.0 psi10 s. Results Standard samples of formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid were separated well in 4 minutes,and their linear ranges were 3.8-30.7 mg/L (r=0.997 1),3.3-52.5 mg/L (r=0.996 1),3.1-49.5 mg/L (r=0.999 3),3.0-48.0 mg/L(r=0.992 5),7.5-60.5 mg/L (r=0.999 5),respectively,their average recoveries were 99.29%,98.90%,99.65%,99.35% and 98.06%,respectively. The RSD values (n=6) of formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid were 0.67%,1.36%,0.65%,0.42%,1.44%,respectively. Conclusion The method is simple,rapid and accurate for detecting the organic acids in bacterial metabolites in fermentation liquor.Key words:metabolic product;organic acid;highperformance capillary electrophoresis代谢流量是细胞生理学的一个基本决定因素，也是代谢途径中最重要的参数。对细菌进行代谢流量分析，特别是代谢产物中小分子有机酸的分析，有助于通过基因工程手段定向地、有目的地改变限制细胞代谢的关键途径，以更好地理解和利用细胞代谢进行化学转化、能量转导和活性产物表达1。在发酵过程中，产酸发酵细菌能将有机物转化为以脂肪酸和醇为主的末端产物，同时生成新的细胞物质。产酸发酵速率较快，末端产物主要有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸等脂肪酸以及醇类(乙醇等)、二氧化碳、氢气、氨、氮气等2。通过分析这些发酵末端产物可以了解细菌的代谢途径，而代谢通量的分析可以使所需要的一些关键操作单元协调运行，从而达到副产物最小而产率最优的目的3。毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有效率高、分离检测样本的速度快、所需要的样本和试剂少、检测的模式多且可以和其他技术联用、试剂易得廉价、能够实现自动化的优点，越来越广泛地被用于有机酸的分析4。影响有机酸分离的主要因素有：缓冲溶液的种类、缓冲溶液的pH 值、电渗流改性剂和添加剂、分离电压等。本研究建立了CE法(区带电泳分离模式)测定小分子有机酸的方法，并对缓冲溶液的种类、pH值以及添加剂等对电泳分离条件进行了研究，从而为研究细菌的代谢途径提供技术手段。1 材料与方法1.1 仪器和试剂高效毛细管电泳仪：Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳系统(32KaratTM Software ver 5.0) ，毛细管为Beckman Coulter未涂层50 m 60 cm (有效长度50 cm)。甲酸、乙酸(Sigma公司，色谱纯)，丙酸、丁酸、乳酸(Sigma公司，分析纯)，四硼酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(广州市化学试剂厂，分析纯)。所有溶液均用超纯水配制和稀释，标准样品和缓冲液经0.22 m滤膜过滤后进样。1.2 方法1.2.1 毛细管电泳环境的平衡 每次进样前毛细管先用水洗3 min，再用0.1 mol/ L的NaOH溶液冲洗3 min，水洗3 min，然后再用缓冲液冲洗5 min。每次更换试样时均用缓冲液清洗510 min，所需时间以基线平稳为准。1.2.2 检测波长的选择 以190250 nm为检测波长，检测各种有机酸和运行缓冲液的紫外吸收特性，选择各有机酸吸光度相对较大、而缓冲液吸光度相对较小的波长为检测波长。1.2.3 缓冲液浓度的选择 采用214 nm检测波长，分离电压-20 kV，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s，在pH值为10.5的情况下，评价 1025 mmol/L的硼砂缓冲体系。1.2.4 缓冲液pH的选择 分别以pH 9.0、pH 9.5、pH 10.0、pH 10.5、pH 11.0的缓冲溶液进行分离，各有机酸分别进样，以缓冲液pH值对各有机酸的保留时间作图。1.2.5 分离电压的选择 分别以10、15、20、25 kV为分离电压进行分离，各有机酸分别进样，以分离电压对各有机酸的保留时间作图。1.2.6 分离温度的选择 分别以15、20、25、30、35 为分离温度进行分离，各有机酸分别进样，以分离柱温对各有机酸的保留时间作图。1.2.7 各种有机酸标准样品的定性和定量 将各种单一有机酸液依次进样,记录各自保留时间。以上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(每个样品平均进样3次)，以有机酸浓度对峰面积作图,建立标准曲线。1.2.8 有机酸混合样品的分析 配制不同浓度的有机酸标准混合液进行定量分析，积分计算峰面积，比较计算值与实际值的误差，得出样品回收率和检测精确度，论证分析方法的准确性和重复性5。转贴于 中国论文下载中心 2 结 果2.1 发酵液中小分子有机酸的紫外吸收特性大多数有机酸在200 nm以上无吸收或吸收很小，用间接紫外检测时其背景电解质吸收要求尽可能低。缓冲溶液中硼砂的紫外吸收较低，因此试验了硼砂溶液的紫外吸收特性。图1、图2分别为各种有机酸标准样品和背景电解质硼砂的紫外吸收光谱。结果表明：当波长小于220 nm时，大多数有机酸都有紫外吸收;当波长小于210 nm时，背景电解质的紫外吸收增加很快，影响有机酸的测定。综合考虑，选择214 nm作为检测波长，在该检测波长处常见有机酸都有比较理想的吸收值。2.2 电渗流改性剂对分离的影响有机酸阴离子的电泳方向与电渗方向相反，通常加入阳离子表面活性剂使电渗反向，从而与有机酸阴离子的电泳方向一致，以缩短分析时间。因此本实验在缓冲液中加入0.5 mmol/L的CTAB作为电渗流改性剂。实验发现，在未加CTAB之前，5种有机酸在20 min内才能得到分离，加入CTAB后时间缩短到5 min。2.3 最佳反应体系的建立2.3.1 缓冲液浓度的选择 在大多数情况下，随着缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速度降低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，迁移时间延长。而且随着缓冲液浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场强度下毛细管的电流值增大，焦耳热增加。实验考察了不同浓度的硼砂对分析物的影响，分离结果见图3。结果表明，当硼砂浓度从10 mmol/L 增加到20 mmol/L 时，保留时间呈上升趋势;当浓度大于20 mmol/L时，保留时间有所下降;在20 mmol/L时，保留时间最长。为保证体系的稳定性，节约分离时间，提高检测灵敏度，选择10 mmol/L为硼砂缓冲液的最佳浓度。2.3.2 缓冲液pH值的选择 缓冲溶液pH值的调节与控制是优化分离的重要因素。有机酸为弱酸，其pKa值大多在26之间。分析物的电离度依赖于电解质溶液pH值的变化，电离度的不同引起电泳淌度和电渗流淌度的差异，进而影响分离效率和电泳迁移行为。由于在酸性介质中有机酸易被毛细管壁吸附，因而通常在碱性环境下实现分离。本研究选择pH 9.011.0进行实验，分离结果见图4。从图可见，当pH为10.5时，5种有机酸均可完全分离;随着pH的增大，分离度进一步得到改善，但同时使分离时间延长。综合考虑分离度、分离时间和灵敏度，选定硼砂缓冲液的最佳pH为10.5。2.3.3 分离电压的选择 电压是控制柱效、分离度和分析时间的重要因素。分离电压的变化会引起电场强度的改变，进而影响组分的分离。本研究分别考察了电压在1025 kV范围内的分离效果，结果见图5。结果表明，随着电压的增大，柱效提高，因而有机酸的分析时间缩短。但过高的电压会产生较大的焦耳热，导致区带展宽，峰面积下降，从而影响分离效率和分离度。综合比较不同电压下的分离图谱，发现在20 kV条件下各种有机酸均得到良好的分离而且保留时间适合，峰形也最好。2.3.4 分离柱温的选择 柱温对电解质溶液的黏度、谱带扩展、离子淌度等有直接的影响。柱温试验发现：1535 区间的不同柱温下分离时间变化不大,但对各种有机酸的分离度有较大影响。在柱温为30 时，各种有机酸的分离都能较好满足工作需要，因此选择30 作为实验柱温。2.3.5 最佳反应体系 综合以上各个优化条件，最终选用的毛细管分析体系为：214 nm为检测波长，10 mmol/L (含0.5 mmol/L CTAB)的硼砂作为缓冲溶液，pH值为10.5，分离电压为-20 kV，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s。2.4 各种有机酸标准样品的定性与定量将各种单一有机酸液依次进样，记录各自的保留时间：甲酸为2.68 min，乙酸为3.02 min，丙酸为3.13 min，丁酸为3.25 min，乳酸为3.47 min。以上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(同一批次每个样品平均进样3次取平均值，系列实验重复6次)，以有机酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，建立标准曲线，计算相关系数并建立回归方程，见表1。从表1中的线性回归方程可知，在实验样品的浓度范围内，各种有机酸的线性关系良好，用该种方法定量准确度可以得到保证。2.5 有机酸混合样品的分析配制有机酸标准品混合液,根据已确定的各项实验参数进行分析,电泳分析图谱见图6。通过积分计算峰面积，再返回标准曲线对照，得出各种有机酸的含量及样品回收率和检测精密度，见表2。表1 有机酸工作曲线的特征参数表2 有机酸标准品混合液中各有机酸的含量及回收率3 讨 论毛细管电泳自问世以来，主要用于药品、氨基酸、核酸等物质的分离检测。从本文结果可见，在利用毛细管电泳进行分离分析时，缓冲液的种类、浓度、pH值和分离电压、柱温都对分离有重要的影响。适量电渗流改性剂CTAB的加入明显增进电迁移速率，缩短分离的时间。缓冲液的pH值对分离的影响最大，pH值不仅影响色谱峰的形状和有机酸样品的保留时间，更重要的是，不适合的pH条件根本不能使各有机酸得到分离。分离电压的提高主要是影响到有机酸的保留时间，同时如果过高电压导致产生的焦耳热也会影响峰形。实验表明所建立的方法简单、快速、准确、重