李雨论文2013版 3 (3) 2.doc

西安医学院药学院本科学位论文 本 科 毕 业 论 文 论文题目 高效液相色谱法测定甲磺酸帕珠沙星的含量 院 系 部 药学院 专业班级 药学专升本1105班 姓 名 李雨 指导教师 席志芳 课 题 完成场所 陕西省食品药品检验所 论文提交日期： 2013 年 05 月 30 日高效液相色谱法测定甲磺酸帕珠沙星的含量【摘要】目的：采用高效液相色谱法测定甲磺酸帕珠沙星的含量。方法：采用HPLC法对其进行定量，色谱条件为C18柱（ Kromasil 250mm4.6mm，5m，Sweden），0.25%三乙胺水溶液-乙腈（88:12）为流动相，流速为1.2ml/min,柱温30，检测波长243nm。结果：甲磺酸帕珠沙星峰与其他峰分离良好，在85.75171.9g范围内呈良好线性关系（r=0.9974，n=6），平均回收率为99.56%，RSD=0.34%（n=9）。结论：该方法简便准确，结果可靠，适用于甲磺酸帕珠沙星含量的测定。【关键词】：高效液相色谱法；甲磺酸帕珠沙星；含量测定High performance liquid chromatography method for the determination of the mesylate pazufloxacin Mesylate.Abstract Objective：To establish a HPLC method for assay of content in Mesylate pazufloxacin. Methods: HPLC method for its quantitative chromatographic conditions for the column (Kromasil 250 mm 4.6mm, 5，Sweden), 0.25% triethylamine aqueous solution - acetonitrile (88:12) as the mobile phase at a flow rate of 1.2ml / min, column temperature 30, detection wavelength of 243nm. Results: The the mesylate pazufloxacin peak with other peaks well separated, in the 85.75171.9g within the scope showed a good linear relationship (r = 0.9974, n = 6), the average recovery rate to 99.56%, RSD = 0.34% (n = 9). Conclusion: The method is simple, accurate, and reliable results, suitable for the mesylate pazufloxacin Determination.Key words：HPLC; Mesylate pazufloxacin; Determination of content目录前言1实验部分11 仪器与试药11.1 仪器11.2 试药12 溶液的配制12.1 供试品溶液配制12.2 对照品溶液配制13 方法与结果23.1 色谱条件与系统适用性试验23.1.1 色谱条件的确定23.2 专属性试验53.2.1 对照试验53.2.2 粗品试验53.2.3 加速降解试验53.2.4 强光降解试验53.2.5 酸降解试验63.2.6 碱降解试验63.2.7 中间体实验63.3 线性范围63.4 重复性试验73.5 检测限与定量限73.6 稳定性试验73.7 精密度试验83.8 回收率实验83.9 样品测定84 结论95 讨论9参考文献11致谢信12II前言甲磺酸帕珠沙星是第四代喹诺酮类抗菌药,为日本宫山化学公司研制的一种新型哇诺酮类抗菌药制剂 ,它在原有的喹诺酮药物位引入一个1-氨基-1-环丙基，比原来的喹诺酮类抗菌药具有更强的抗菌活性和更广泛的抗菌谱，而且，其光毒性明显降低1。体内外研究表明帕珠沙星抗菌谱广 ,与受试的环丙沙星、头孢他暖、亚肤培南、庆大霉素等相比 ,对 MR5 A抗菌活性突出 ,抗革兰氏阴性菌活性优于头孢他暖、亚肤培南及庆大霉素 ,与环丙沙星相似 ,对部分厌氧菌亦有很强抗菌活性。对机体呼吸、循环、消化及神经各系统功能无明显影响。临床主要用于治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的呼吸道、尿道感染等疾病，并取得了很好的临床疗效25。本研究参考中国药典2010版二部中甲磺酸帕珠沙星含量测定方法 ,及国外文献的补充，建立高效液相色谱法 ,对甲磺酸帕珠沙星进行质量分析。实验部分1 仪器与试药1.1 仪器Waters Alliance高效液相色谱仪，德国赛多利斯BS224S型电子天平,Waters2478紫外检测器；美国PE公司紫外分光光度计；Empower色谱管理软件；C18柱：Kromasil（250mm4.6mm，5m，Sweden）；C18柱：ZOABOX ODS（250mm4.6mm，5m，USA）；Millipore纯水机；66025型超声清洗器，德国塞多利斯公司PP-15E酸度计。1.2 试药甲磺酸帕珠沙星原料药（西安万隆制药有限责任公司，批号010601-010612）；甲磺酸帕珠沙星对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号023-05003）；乙腈为色谱级（天津康德科技有限公司）；三乙胺、磷酸二氢钾、磷酸为分析纯(西安化学试剂厂)；水为经Millipore纯水机处理过的高纯水。2 溶液的配制2.1 供试品溶液配制 取经105干燥至恒重的本品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。2.2 对照品溶液配制 取经105干燥至恒重的对照品约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。3 方法与结果3.1 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.25%三乙胺水溶液：乙腈（88:12）用磷酸调节pH至3.0为流动相，用流速为1.2ml/min；检测波长为243nm。理论板数按甲磺酸帕珠沙星计不低于2000；甲磺酸帕珠沙星峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。 3.1.1 色谱条件的确定（1） 仪器与试剂 见表1-1表1-1 有关物质检测实验用仪器与试剂Table 1-1 related substances testing laboratory instruments and reagents仪器名称型号生产厂家高效液相色谱仪Waters AllianceU.S.A反相色谱柱Kromasil ODS 4.6250mmSweden反相色谱柱ZABOX ODS 4.6250mmU.S.A酸度计PP-15E德国塞多利斯公司乙腈色谱级天津康德科技有限公司三乙胺AR级西安化学试剂厂磷酸二氢钾AR级西安化学试剂厂磷酸AR级西安化学试剂厂（2） 色谱柱的选择 经过一系列试验，选用C18柱（Kromasil 2504.6mm，5m，Sweden），主成分与有关物质能良好分离，峰形对称性也较好，理论塔板数较高，故选此为本品试验所用色谱柱。（3） 流动相的选择 取本品，调节流动相的比例，考察本品可适用的流动相，结果选择0.25%三乙胺水溶液：乙腈（88:12）用磷酸调节pH至3.0为流动相，见表1-2。表1-2 甲磺酸帕珠沙星有关物质检测流动相的选择（检测波长245nm，流速1.2ml/min）Table 1-2 mesylate pazufloxacin related substances detected choice of mobile phase(Detection wavelength 245nm, flow rate 1.2ml/min)流动相配比结果水：乙腈=50:50主峰拖尾，杂质未分开水：乙腈=70:30主峰拖尾，杂质未分开0.1mol/l磷酸二氢钾：乙腈=70:30主峰拖尾，同水：乙腈=70:30条件水：乙腈=70:30 调pH至3.0主峰形较好，杂质分离度不够0.5%三乙胺水溶液：乙腈=86:14 用磷酸调pH至3.0主峰形较好，并与杂质能够进行有效分离0.25%三乙胺水溶液：乙腈=88:12 用磷酸调pH至3.0主峰形较好，并与杂质能够进行有效分离0.25%三乙胺水溶液：乙腈=86:12 用磷酸调pH至4.0主峰形较好，与pH为3.0时比较，主峰与杂质峰的分离度较低0.25%三乙胺水溶液：乙腈=86:12 用磷酸调pH至3.0主峰形较好，与杂质不能够进行有效分离（4） 检测波长的选择 取本品适量，用流动相溶解并稀释至每1ml约含5g的溶液，测定紫外吸收光谱，实验表明，本品在243nm处有最大吸收。因此波长利于有色杂质的检出，故检测波长定为243nm。由以上实验，确定系统条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.25%三乙胺水溶液：乙腈：（88:12）用磷酸调节pH至3.0为流动相，用流速为1.2ml/min；检测波长为243nm。理论板数按甲磺酸帕珠沙星计不低于2000；甲磺酸帕珠沙星峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。见图1-1A B C D E F 图1-1 系统适用性试验HPLC色谱图A. 含量对照B.含量样品C.检测限D.空白E.有关物质对照F.有关物质样品Figure 1-1 HPLC chromatogram of system suitability testA.Content control B.Content of the sample C.The detection limit D.Blank E.Related Substances Control F.Samples related substances3.2 专属性试验考虑本品在贮藏过程中受到环境影响，并结合工艺，设计了对照、粗品、中间体、高温、强光、酸、碱及氧化破坏试验，考察系统的可靠性、灵敏性以及样品在破坏条件下的稳定性寻找已知杂质和未知杂质的归属。3.2.1 对照试验取本品约35mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀作为供试品溶液，按照有关物质测定方法测定，色谱图显示，在8.52分钟处出现主峰，在3.75分钟、7.0分钟、7.7分钟、8.5分钟处出现杂质峰，杂质峰与主成分能够有效分离。见图1-13.2.2 粗品试验 取本品的粗品约35mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀作为供试品溶液，按照有关物质测定方法测定，结果在0.93分钟、出现新的杂质峰，7.1分钟处杂质峰增大，归一化方法得此处杂质含量增为0.95%，样品含量为98.6%。3.2.3 加速降解试验 取经120加热48小时的甲磺酸帕珠沙星约35mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液，照有关物质测定方法测定，发现未出现新的杂质峰，本品对热稳定。3.2.4 强光降解试验 取经5000Lx照射10天的甲磺酸帕珠沙星约35mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液，照有关物质测定方法测定，由试验可知，没有出现新的杂质峰，本品对光稳定。3.2.5 酸降解试验 取甲磺酸帕珠沙星约35mg，精密称定，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液，放置6h后，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，照有关物质测定方法测定，由试验发现没有出现新杂质峰，本品在0.1mol/L盐酸溶液中稳定。3.2.6 碱降解试验 取甲磺酸帕珠沙星约35mg，精密称定，置50ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液，放置6h后，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取10l，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间3倍。测定结果在1.8分钟、3.2分钟处出现新的杂质峰，归一化方法得1.8分钟处杂质含量为11.78%，3.2分钟处杂质的含量为0.21%，本品在3%过氧化氢溶液中不稳定；样品中杂质不是氧化所产生的杂质。3.2.7 中间体实验 取中间体进行实验。分别取（S）-10-（1-氰基）-9-氟-3-甲基-2,3-二氢-7-氧代-7H-吡啶并1,2,3-de1,4-苯并-嗪-6-羧酸乙酯；（S）-10-（1-氰基环丙基）-9-氟-3-甲基-2,3-二氢-7-氧代-7H-吡啶并1,2,3-de1,4-苯并-嗪-6-羧酸乙酯；（S）-10-（1-甲酰胺基）-9-氟-3-甲基-2,3-二氢-7-氧代-7H吡啶并1,2,3-de1,4-苯并-嗪-6-羧酸乙酯；分别加流动相加热溶解，冷却过滤后，取10l进样，结果见试验结果图谱并比较可知，间体主峰在16.9分钟处、间体主峰在17.7分钟处、间体主峰在7.9分钟处。各中间体与甲磺酸帕珠沙星主成分峰均能够有效分离。由以上表明，本HPLC方法专属性好，本品与中间体及降解产物能够有效分离。7.8分钟处的杂质为中间体（S）-10-（1-甲酰氧基）-9-氟-3-甲基-2,3-二氢-7-氧代-7H吡啶并1,2,3-de1,4-苯并-嗪-6-羧酸乙酯，其他杂质为未知杂质。 3.3 线性范围精密称取经105干燥至恒重的本品适量，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，取5ml置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液，分别取供试液进样10l，按含量测定项下方法规定，以峰面积为纵坐标，以样品浓度为横坐标，进行线性回归。结果表明，在85.75171.90l/ml呈线性，见表3-1。表3-1 峰面积与浓度线性关系回归方程：y=14584x-1500 R2=0.9974Table 3-1, a linear relationship between peak area and concentrationRegression equation:y=14584x-1500 R2=0.9974样品浓度C（g/ml）85.75112.80125.95142.35171.90平均峰面积A142401717998691953673221904626818253.4 重复性试验取供试品溶液10l进样，同一实验人同一条件下试验6次，计算含量的相对标准差(RSD%),RSD=0.21%（n=6）。见表4-1。表4-1 重复性试验结果Table 4-1 Repeatability test results样品称样量（g）平均峰面积含量（%）平均含量（%）RSD%对照品0.0281221627760.025291945797样10.02435186506199.5799.500.21样20.02900222462499.72样30.02473188562199.12样40.02452187832699.58样50.02896221812199.57样60.02451187483799.443.5 检测限与定量限经过一系列试验，最终按下述步骤做出检测限和定量限：精密称取本品0.02548g，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取对照溶液10l，注入液相色谱仪，观察主成分峰高度约为基线噪音的200倍；精密量取对照溶液5ml，置100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取10l，注入液相色谱仪，观察主成分峰高度，约10倍于基线噪音，计算此时甲磺酸帕珠沙星浓度为127.4ng/ml，即本品的定量测定检测限度为1.27ng；精密量取对照溶液2ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取10l，注入液相色谱仪，观察主成分峰高度，约2倍于基线噪音，计算此时甲磺酸帕珠沙星浓度为0.25ng/ml，即本品最低检测限度为0.25ng。见图1-1。3.6 稳定性试验 精密称定取经105干燥至恒重的甲磺酸帕珠沙星样品0.02745g，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，在0、2、4、6、8、12小时时分别吸取10l，注入液相色谱仪，记录色谱图，并计算其RSD%，试验表明本品在流动相溶液中放置24小时，性质稳定，见表5-1。表5-1 溶液稳定性试验结果Table 5-1 Solution stability test results 时间（hr）0246812峰面积195834019604081956130195292819716801959216平均峰面积1959784RSD（%）0.333.7 精密度试验取同一对照品溶液10l进样，依法测定6次，记录色谱图。测量峰面积，计算含量的相对标准差(RSD%),RSD=0.21%（n=6）。3.8 回收率实验精密称取高、中、低3份甲磺酸帕珠沙星对照品适量，按照处方的比例加入其它辅料，配制9份甲磺酸帕珠沙星注射液，照“2.1；2.2”项下方法，以外标法计算样品的含量和相对标准偏差RSD%，见表6-1。表6-1 帕珠沙星回收率实验结果Table 6-1 pazufloxacin recovery results样品称样量（g）平均峰面积含量（%）平均含量（%）RSD%对照品0.0253521202520.027432307666低浓度供试品溶液0.02162180378199.4699.560.340.02180181414099.210.02183182299399.55中浓度供试品溶液0.02611216846799.010.02606218284199.850.02629220001899.76高浓度供试品溶液0.030122528055100.060.03066255470199.330.03128261779299.773.9 样品测定取经105干燥至恒重的甲磺酸帕珠沙星约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置于10m量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密吸取10l，注入液相色谱仪；另取经105干燥至恒重甲磺酸帕珠沙星对照品约25mg，精密称定，同法测定。见图1-1。按外标法以峰面积计算，结果见表7-1与图1-1。 表7-1 甲磺酸帕珠沙星三批样品含量检测结果Table 7-1 mesylate pazufloxacin content of the sample batches of test results批号称样量（g）平均峰面积含量（%）平均含量（%）对照品0.0275921223980.0248519119690106010.02417185893899.5699.510.02675204706099.470106050.02493191378299.7899.750.02891221792399.720106120.02401183731899.4799.430.02897221518399.394 结论为了控制甲磺酸帕珠沙星的质量，本文建立了甲磺酸帕珠沙星含量的测定方法，通过改变色谱条件和流动相以及酸碱比等，利用HPLC技术，较好的测定了甲磺酸帕珠沙星的含量，并实现了HPLC测定甲磺酸帕珠沙星含量的条件优化。探究得到流动相（0.25%三乙胺水溶液：乙腈）的配比为88:12，流动相的pH值为3.0，紫外检测波长在243nm时，甲磺酸帕珠沙星各组分均能得到良好的分离，且无拖尾现象。本方法准确、灵敏、可靠，溶液在室温下的放置稳定，溶液浓度与峰面积线性关系好，测得的三批样品标示含量均在95%105%范围内。结果表明，本文建立的HPLC测定方法灵敏度高，测定结果准确、重现性好，对于该制剂的含量测定，具有实际参考意义。5 讨论5.1 试验中发现，流动相的酸碱度及配比对分离效果均有影响，尤其是pH值对分离效果的影响更大，将流动相的pH值由4.0降至3.0，当流动相的pH值为3.0，流动相（0.25%三乙胺水溶液：乙腈）的配比改为88:12时甲磺酸帕珠沙星各组分均得到很好的分离68，并且无拖尾现象。5.2 本方法准确、灵敏、可靠，溶液在室温下放置稳定，溶液浓度与峰面积线性关系好，测得的3批样品的标示含量均在95%105%范围内。5.3 测定波长的选择：甲磺酸帕珠沙星流动相溶液在200-400nm范围内进行紫外光谱扫描，结果在243nm和332nm处均有最大吸收峰，考虑