蛋白质的沉淀分离技术.doc

蛋白质的沉淀分离技术摘要: 沉淀分离是经典的化学分离方法，在历史上曾为化学和放射化学的发展作出重大贡献。由于沉淀分离方法简便，实验条件易于满足，再加之近年来一些高选择性的有机沉淀剂和有机共沉淀剂的研究和应用，使传统的沉淀分离方法仍具有旺盛的生命力，被广泛应用于化学工业、食品工业及生化领域中。沉淀分离法可用于常量组分的分离，也可用于痕量组分的富集。工业上应用沉淀技术分离生化产物最典型的例子是蛋白质的分离提取。本文概述了蛋白质处理方面的几种常用沉淀分离技术的基本原理、特点、所用试剂及影响因素等。关键词 :蛋白质; 沉淀分离技术前言 具有生理活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已必不可少,在医疗和食品领域已逐渐得到广泛应用。蛋白质具有多种功能性质,每一种特性都会给食品及其加工过程带来特定的效果1 。一方面,蛋白质作为功能性物质,常存在于复杂的混合体系中,因此,需要将其从原料中分离纯化;另一方面,蛋白质是一种不稳定的有机高分子物质,往往会给生产加工带来不利,故也需要对其进行分离纯化。作为一种应用较早的分离技术,沉淀分离已在蛋白质分离中广泛应用 2 。1 无机沉淀剂沉淀分离法盐析法31. 1 基本原理及特点盐析沉淀是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用,且至今仍广泛应用的方法。其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中,随着盐浓度的逐渐增加,由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低,不需要特别设备,操作简单、安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。应用实例有大豆异黄酮的提取和大豆蛋白质的分离,其基本工艺流程为:大豆豆粕乙醇提取过滤盐析离心2 。1. 2 盐的种类及选择蛋白质盐析常采用中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中,应用最广泛的是硫酸铵,其优点有: 溶解度大。25 时大约每升水可溶解767 g 硫酸铵,在此溶解度范围内,许多蛋白质和酶都能被盐析沉淀出来; 温度系数小。在低温时,硫酸铵的溶解度受温度影响不大,对于需要在低温条件下进行纯化的酶,有利于保持酶的活性; 硫酸铵不易引起蛋白质变性,对于多种酶还具有保护作用,且价格低廉,来源丰富; 使用后的废液可作为农作物氮肥4 。缺点: 缓冲能力较小; 硫酸铵中含有氮,因此,影响蛋白质的定量分析,尤其是在采用凯氏定氮法和双缩尿法进行测定时。1. 3 盐析法的影响因素蛋白质种类。不同溶质的盐析常数( Ks) 和盐浓度为0 时,蛋白质溶解度的对数值() 均不相同,所需的离子强度也不同; 蛋白质浓度。蛋白质浓度较大时,中性盐的极限沉淀浓度低,共沉作用强,分辨率低,但用盐量少,蛋白质溶解损失小;而蛋白质浓度较小时,情况相反,故一般蛋白质浓度控制在2 %3 %为宜; p H 值。当p H 值在蛋白质等电点附近时,用盐量少,蛋白质得率高; 温度。温度升高,蛋白质溶解度升高,而多数蛋白质在高盐浓度下,其溶解度反而下降,如胃蛋白酶,但大豆球蛋白例外; 离子强度。对于同一类型的蛋白质,随离子强度由低到高的变化,蛋白质也随之发生由盐溶至盐析的变化。对不同类型的蛋白质,盐析时所要求的离子强度不同,一般分离多种蛋白质时采用分步盐析法; 离子类型。通常情况下,半径小、带较高电荷的离子盐析效果较好。2 有机沉淀剂的沉淀分离技术2. 1 基本原理及特点向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂,降低水的活度,随着有机溶剂浓度的增大,水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低,溶液的介电常数下降,蛋白质分子间的静电引力增大,从而使蛋白质凝聚和沉淀。有机沉淀剂沉淀分离技术的特点是: 选择性较高,即一定浓度的有机溶剂只沉淀分离某一种或某一类组分; 沉淀后所得产品不需脱盐,残留的沉淀剂通过挥发即可除去。而有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用,因而常常需在低温下进行操作。应用实例有高粱蛋白质的提取,其基本工艺流程为:高梁粉萃取离心沉淀水洗烘干5 。2. 2 有机沉淀剂有机沉淀剂有乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、异丙酮等,其中最常用的是乙醇和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇,由于甲醇、丙酮均有一定毒性,故使用时必须谨慎。此外,乙醇还可以作为核酸、核甘酸、糖类、氨基酸、果胶等成分的沉淀剂。2. 3 有机沉淀剂分离技术的影响因素蛋白质相对分子质量与有机溶剂用量。一般来说,待分离组分的相对分子质量越小,有机溶剂用量就越多。不同浓度的有机溶剂能使溶质中不同的组分先后沉淀,起到分步沉淀的效果; 温度。有机溶剂存在时,蛋白质溶解度随温度的降低而降低,且蛋白质、酶等对温度变化较为敏感,温度升高时,易发生变性。因此,沉淀蛋白质应尽量采用低温操作;p H 值。蛋白质、酶等大多数属于两性电解质,故选择其等电点处p H 值,可最大限度地进行沉淀。在一定的有机溶剂浓度下,改变p H 值,即可有效选择分段沉淀,分离不同的组分。3 等电点沉淀分离法两性电解质在溶液p H 值处于等电点时,分子表面净电荷为零,导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏,分子间引力增加,溶解度降低。等电点沉淀分离法的基本原理即通过调节溶液的p H值,使两性电解质的溶解度下降,从而沉淀析出6 。蛋白质是多价的两性电解质,通常在偏酸性溶液中带正电,在偏碱性溶液中带负电。一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内,故在等电点沉淀操作中,大多通过加入无机酸如盐酸、磷酸和硫酸等调节pH 值。应用实例有大豆蛋白的“碱提酸沉”法,基本工艺流程为:豆粕原料二次碱提粗滤酸沉打浆回调改性喷粉成品 3 。4 变性沉淀分离技术4. 1 基本原理及方法利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境因子敏感性的差异而选择性地使一种组分发生变性形成沉淀,而另一些组分保持不变,从而达到分离、除杂和提纯的目的。变性沉淀分离的方法有: 热变性沉淀分离。利用蛋白质热稳定性不同的特点,使蛋白质组分之间得以分离,同时使蛋白质与水及其他可溶物分离,此法常用于组织化植物蛋白的生产7 ; 选择性酸碱变性沉淀分离。利用酸碱变性原理,通过调节溶液p H 值,可有选择地去除杂蛋白,常用于生化制备中8 ; 利用酶进行变性分离。利用酶的催化作用使一些蛋白质变性,从而沉淀分离,如凝乳酶催化牛乳酪蛋白的沉淀; 利用表面活性剂或有机溶剂引起变性沉淀分离。在制备核酸时,可加入含水酚、氯仿以及十二烷基磺酸钠等试剂,有选择地使蛋白质发生变性沉淀,达到去除杂质、提纯核酸的目的。4. 2 影响蛋白质变性的因素温度。在较高温度作用下,蛋白质的二级、三级和四级结构的弱键断裂,破坏了肽链原来特有的排列和空间结构,使原来在大分子内部的极性基团转到分子表面,促进蛋白质分子相互凝集而沉淀,但温度过高又会使蛋白质发生变性6 ; p H 值。大部分蛋白质在p H 410 的范围内是比较稳定的,超过这个范围强酸或强碱会使蛋白质分子内的基团带电性质发生变化,从而破坏静电引力所形成的键,使原来的构象发生变化,导致蛋白质变性; 其他化学因子。能使蛋白质变性的化学试剂有甲酸、乙酸等酸类,甲醇、乙醇等醇类,还有二脲、氯仿、酚等,以及表面活性剂如十二烷基磺酸钠等,它们与蛋白质高度结合,可拆散蛋白质的亚基从而使其变性。此外,酶作用也可使蛋白质变性。5 絮凝分离技术5. 1 基本原理絮凝分离主要是通过溶液中的颗粒凝集、双电层的压缩和电荷的中和作用、桥连作用、沉淀物网捕作用等机理把溶液中的微小胶体、颗粒及悬浮物除去并分离的技术。应用实例有葎草叶蛋白的提取,其基本工艺流程:葎草叶打浆浸泡压汁离心分离加热沉淀烘干9 。5. 2 絮凝剂的种类无机阳离子絮凝剂:三氯化铝、硫酸铝、三氯化铁、明矾、硫酸亚铁、硫酸铁等; 无机阴离子絮凝剂:一氧化钙、氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钠等; 铝盐无机高分子絮凝剂:碱式氯化铝、碱式硫酸铝; 铁盐无机高分子絮凝剂:碱式氯化铁、碱式硫酸铁;人工合成阳离子型有机高分子絮凝剂:丙烯酰胺- 丙烯酸- 2 - 羟基丙酯基三甲基氯化铵共聚物、丙烯酰胺- 甲基丙烯酸乙酯基三甲基氯化铵共聚物等; 人工合成阴离子型有机高分子絮凝剂:聚丙烯酸钠、聚苯乙烯磺酸钠、丙烯酰胺- 丙烯酸钠共聚物等; 人工合成非离子型有机高分子絮凝剂:聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚、聚丙烯酰胺等; 天然有机高分子絮凝剂:纤维素、三醋酸纤维素、淀粉、多糖、环糊精、果胶、树胶、蛋白质、动物胶等。5. 3 影响絮凝作用的因素p H 值。一般情况下,阳离子型的絮凝剂适合在酸性和中性环境中使用;阴离子型絮凝剂适合在中性和碱性环境中使用; 温度。絮凝作用最适温度在2030 之间。水温过高,化学反应速度过快,形成絮凝体系小,且使絮凝体的水合所用增加,能量消耗大;水温过低,絮凝剂水解反应变慢,导致水解时间过长,效率降低,且温度过低时,水的黏度增大,也会增加水对絮凝体的撕裂作用,使絮凝体变得细小,不易分离; 搅拌速度和时间。一般情况下, 搅拌速度以40 80 r/ min 为宜, 不超过100 r/ min ; 搅拌时间以2 4 min 为宜, 不超过5 min 。搅拌速度过快,搅拌时间过长,会将大颗粒固体搅碎变成小颗粒而不易沉淀;而速度过慢,时间过短,则会导致絮凝剂和胶体颗粒不能充分接触,不利于絮凝剂捕集胶体颗粒,也就无法发挥絮凝作用;高分子絮凝剂的性质和结构。线性结构有机高分子絮凝剂的絮凝作用较强,而环状或支链结构的效果较差。有机高分子絮凝剂的一些官能团, 如- COONa 、- R3NRCl 等过多时,由于电荷密度过高而使絮凝效果较差; 絮凝剂的用量。絮凝剂作用效果随其用量的增加而增加,但用量过大也会使形成的絮凝体重新变成稳定的胶体,反而降低絮