酶工程及酶的特性.doc

l 首先对酶进行了命名1878年 库尼首先把这种物质称为酶。1896年 巴克纳兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。1982年 Cech 、1983年Altman等分别发现核酶 。l 什么是酶工程？ 酶的生产与应用的技术过程成为酶工程。酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞和原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用。酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的美，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。l 酶的化学本质 已知大多数酶的化学本质是蛋白质 核酶是核糖酶酶的专一性（特异性）是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。1. 绝对专一性 一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为 绝对专一性。例如，乳酸脱氢酶催化丙酮酸进行加氢反应生成L-乳酸；而D-乳酸脱氢酶却只能催化丙酮酸加氢生成D-乳酸。2. 相对专一性一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。例如，酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。l 测定酶活力，应测定酶促反应的初速率。（即底物消耗量5时测得的反应速度）测酶活的步骤（1）根据酶的专一性，选择适宜的底物（2）确定反应条件（3）在一定的条件下，将一定量的酶液与底物混合均匀，记下开始反应的时间。（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量，计算酶的活力。l 终止酶反应的方法 l 酶的活力单位酶活力单位：是指在特定条件下，在1min内能转化1微摩尔底物的酶量，或转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。 l 酶的比活力是指在特定的条件下。每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。l 酶的分类（1）从化学组成上看，分为两类： 单纯酶（单成分酶）和结合酶（双成分酶） 结合酶：全酶=酶蛋白+辅因子 辅因子：辅基 、辅酶。辅基与酶蛋白结合的更牢固（2）根据酶蛋白的结构特点： 单体酶和寡聚酶（3）根据酶在代谢中所处的地位、含量与活性情况，将酶分为：恒态酶和调节酶恒态酶：是指构成代谢途径和物质转化体系的基本组成成分，在细胞中的含量相对恒定，其活性仅受反应动力学系统本身的组成因素调节。 调节酶又分为潜态酶、别构酶、同工酶和多功能酶潜态酶：是指通常以无活性的酶原状态存在，而在机体需要时再转变为活性状态的酶。别构酶:在结构上除了具有能和底物相结合、并催化底物进行反应的活性中心外，还具有能和效应物相结合的调节基因。 同工酶:在同一生物体中，催化相同反应，但结构基因不同，因而酶的一级结构、酶的物理化学性质以及酶的其他性质都可能有所差异的酶 （4）组成酶和诱导酶 培养微生物细胞时，正常培养不产生乳糖酶，加入乳糖后产生了乳糖酶。这说明乳糖酶是诱导酶而不是细胞内的组成酶。（5） 胞内酶和胞外酶 此外：抗体酶、克隆酶、突变酶（6） 酶的分类l 提高酶产量的措施1、添加诱导物(在诱导酶的发酵生产过程中的某个适宜时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量)（1）酶的作用底物：许多诱导酶可以由其作用底物诱导产生。（2）酶的反应产物：有些酶可以由其催化反应产物诱导产生。（3）酶的底物类似物：有些酶的反应产物的类似物对酶的生物合成也有诱导效果。2、控制阻遏物浓度 控制阻遏物的浓度时解除阻遏、提高酶产量的有效措施。3、添加表面活性剂（离子型表面活性剂对细胞都有毒害作用，因此生产酶要摒弃离子型活性剂） 表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。常用的有Tween 80 、Triton X-1004、添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机制未阐明的物质。例如，植酸钙镁l 酶生物合成调节1、分解代谢物阻遏作用 容易利用的碳源阻碍某些酶生物合成的作用。加入CAMP也、减少容易利用的碳源都可解除阻遏作用。2、酶合成的诱导作用 加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象。3、酶生物合成的反馈阻遏作用（产物阻碍作用）酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏的现象。l 酶生物合成的模式1、同步合成型（生长偶联型）其生物合成伴随着细胞的生长而开始，在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成，当细胞生长进入平衡器后，酶的合成随着停止。所对应的mRNA很不稳定。该类型酶的生物合成可以由其诱导酶生成，但是不受分解代谢物的阻遏作用，也不受产物的反馈阻遏作用。2、延续合成型（适于工业发酵）酶的合成时伴随着细胞的生长而开始的，但细胞进入平衡期后，酶还可以持续一段时间，所对应的mRNA很稳定。3、中期合成型 酶的合成是在细胞生长一段时间后才开始的，进入平衡期后酶的合成也随之停止。特点：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，酶所对应mRNA稳定性较差。4、滞后合成型（非生长偶联型） 在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成的大量积累。只有当细胞进行到平衡期后，酶才开始合成。酶对应的mRNA稳定性很好。阻遏作用可能是可利用的碳源减少产生的。总结：影响酶生物合成模式的主要因素有两个，即mRNA的稳定性和培养基中是否存在阻遏物。l 产酶动力学 dE /dt =( +) X同步合成型： dE /dt = X中期合成型： =0时，无酶产生；阻遏作用解除后与同步合成型相同。滞后合成型： dE /dt =X延续合成型： dE /dt =( +) XX细胞浓度，以每升发酵液所含的干细胞重量表示（g DC/L）细胞比生长速率（1/h） 生长偶联的比产酶系数，以每克干细胞产酶的单位数表示(U/gDC) 非生长偶联的产酶速率，以每小时每克干细胞产酶的单位数表示（U/h*g DC ）E酶浓度，以每升发酵液中所含的酶单位数表示（U/L）T时间（h）l 酶的分离纯化 酶分离纯化工作的基本原则（酶分离纯化工作中应注意的问题）：1、防止酶变性失效（1）除少数例外，所有操作必须在低温下进行，特别是在有机溶剂存在下更应小心；（2）应控制整个系统不要过酸或过碱，同时防止调整pH时局部酸碱过量；（3）酶和其他蛋白一样，易在溶液表面或界面形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫的形成；（4）重金属等易引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。2、选择有效的分离纯化方法纯化方法：（1）溶解度：盐析法、有机溶剂沉淀法等（2）分子大小：凝胶层析、超滤、超速离心（3）电学、解离性质：吸附层析、离子交换层析、电泳（4）酶的亲和作用：亲和层析 （5）稳定性：热变性、酸碱变性、表面变性法等可能遗漏的内容补充：l 酶活性测定贯穿纯化过程的始终（1）比活力用于计算某一纯化步骤后的纯化效果，即纯度的提高；（2）总活力用于计算抽提或纯化步骤后酶的得率或回收率。l 膜分离技术定义 借助于一定口径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和特性颗粒或分子分离的技术。l 沉淀分离方法1盐析沉淀法 原理:是利用不同蛋白质在不同的盐浓度下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。主要用于蛋白类酶的分离纯化。盐改变蛋白质的溶解度是由于中性盐使蛋白质脱去水化层。2等电点沉淀法原理：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的PH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。3有机溶剂沉淀法原理：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 有机溶剂使酶能沉淀析出，是由于有机溶剂的存在降低了溶液的介电常数。4.复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使其与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法。l 离子交换层系和凝胶层析的操作离子交换层析 是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换层析的主要操作过程：1）装柱，有干法装柱和湿法装柱，干法装柱是将干燥的离子交换剂一边震荡一边慢慢倒入柱内，使之装填均匀，然后再缓缓加入缓冲溶液。湿法则是先装入溶液，再将处理好的离子交换剂边搅拌便倒入层析柱内，让离子交换剂慢慢自然沉降。2）上柱（上样） 离子交换柱装置好后，经过转型称为所需的可交换离子，再用缓冲液进行平衡，然后将欲分离的混合物溶液加入到离子交换柱中，即为上柱。3）洗脱与收集 采用适当的洗脱剂将交换吸附在离子交换剂上的组分逐次洗脱下来。4）离子交换剂的再生 洗脱后，为使离子交换剂恢复原状以便重复使用，离子交换剂需经再生处理。凝胶层析 又称凝胶过滤层析 或分子排阻层析 分子筛层析 凝胶渗透层析操作过程：（1）凝胶的处理与装柱（2）平衡（3）上样（柱） （4）洗脱和收集原理：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布在凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子则能进入凝胶的微孔内，不断的进出于一个个颗粒的微孔内外，小分子物质移动速度比大分子慢。从而使各组分按照相对分子质量由大到小的顺序流出。l 凝胶电泳分成4类：1、连续凝胶电泳只用一层凝胶，采用相同的PH值和相同的缓冲液。此法配置凝胶时较为简便，但是分离效果稍差，使用于组分较少的样品。2、不连续凝胶电泳采用2层或3层性质不同的凝胶：样品胶、浓缩胶和分离胶，重叠起来使用，采用两种不同的PH值和不同的缓冲溶液，能使浓度较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。3、浓度梯度凝胶电泳采用由上而下浓度逐渐升高、孔径逐渐减小的梯度凝胶进行电泳。梯度凝胶用梯度混合装置制成，主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。4、SDS凝胶电泳 (SDS-PAGE) 主要用于蛋白质相对分子质量的测定。l 凝胶电泳制备后采用什么分离系统？一种为阴离子系统，缓冲液PH值为89，上槽接负极，下槽接正极，用溴酚蓝作为指示燃料，适用于一般蛋白质和核酸的分离；另一种为阳离电泳系统，缓冲液PH4左右，上槽接正极，下槽接负极，可采用亚甲基绿做指示剂燃料，适用于碱性蛋白质的电泳分离。l 加SDS的原因加入SDS制成SDS制成SDS-凝胶电泳，电泳时蛋白质组分的电泳迁移速率主要取决于相对分子质量，而与其形状及所带电荷无关。l 为什么SDS凝胶电泳 不会受蛋白质所带电荷及分子形状的影响？蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，SDS能与蛋白质结合形成蛋白质-SDS复合物，使复合物上带上相同密度的负电荷，并且SDS与蛋白质的结合，引起蛋白质构想的变化。l 论述修饰后酶的变化1、稳定性 比游离酶稳定性好，表现在：（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；（2）保存稳定性好；（3）对蛋白酶的抵抗性增强；（4）对变性剂的耐受性提高。2、最适温度 固定化酶的最适温度与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶有较明显的变化。例如：氨基酰化酶用DEAE-葡聚糖凝胶离子键结合法结合后最适温度比游离酶提高12度。3、最适pH值（1）载体性质的影响载体带负电荷，固定化酶的最适pH值上升；载体带正电荷，固定化酶的最适pH值下降；载体不带电荷，固定化酶的最适pH值不变。（2）产物性质的影响产物为酸性时，固定化酶的最适pH值略高；产物为碱性时，固定化酶的最适pH值略低；产物为中性时，固定化酶的最适pH值不变；4、底物特异性固定化酶的底物特异性与游离酶比较有些不同，变化与底物分子质量的大小有一定关系。对于作用于小底物的酶，固定前后的底物特异性没有明显变化，而既作用大分子底物又作用小分子底物的酶，固定化酶的底物特异性往往发生了变化。l 修饰方法1、氨基修饰 采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构想的方法。酶活力基本不变，但是稳定性大大提高，氨基修饰剂：亚硝酸、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、2，4-二硝基氟苯（）、丹磺酰氯、O-甲基异脲、E-NH2 + TNBS = E-NH-TNB + H2SO32、羧基修饰 采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构想发生改变的方法称为羧基修饰。例如，碳二亚胺可以在比较温和的条件下与酶分子的羧基发生酯化反应。3、巯基修饰 采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生变化，从而改变酶的空间构想、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。4、胍基修饰 采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子的空间构想的方法。5、酚基修饰 通过修饰剂的作用使酶分子上的酚基发生变化，从而改变酶蛋白的空间构想和特性的修饰方法称为酚基修饰。经过酚基修饰，可以改变酶的某些动力学性质，提高酶的催化活性，增强酶的稳定性。酚基修饰的方法主要有：碘化法、硝化法。6、咪唑基修饰 通过修饰剂与咪唑基反应，使酶分子中的组氨酸残基发生改变，从而改变分子的构想和特性的修饰方法称为咪唑基修饰。7、吲哚基修饰 通过改变酶分子上的吲哚基而使酶分子的构象和特性发生改变的修饰方法。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以对吲哚基进行修饰。8、分子内交联修饰 含有双功能基团的化合物如戊二醛、己二胺等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内教练修饰。l 固定化细胞和固定化原生质体有哪些相同与不同？（固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。） 对象项目固定化细胞固定化原生质体目的适用于胞外酶的生产变胞内产物为胞外产物固定化方法吸附法和包埋法凝胶包埋法酶产率提高提高发酵稳定性提高提高生产周期缩短缩短产品分离易于分离纯化易于分离纯化l 酶反应器概念：用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。酶反应器是根据酶的催化特性而设计的反应设备。其设计的目标就是生产效率高、成本低、耗能少、污染少，以获得最好的经济效益和社会效益。 l 设计酶反应器涉及知识点：一、 酶反应器类型 按照应用的酶的类型反应器分两种：一类是直接应用游离酶进行反应，即均相酶反应器；另一类是应用固定化酶进行反应的非均相酶反应器。 根据几何形状和结构：罐型、管型、膜型、片型 按进料出料方式：分批式、半分批式、连续式 按功能结构：膜反应器、液固反应器、气液固反应器 （一）游离酶反应器1、搅拌罐式反应器（分批式、半分批式）优点:无论是分批式还是连续流混合罐型的反应器，都具有结构简单、温度和pH值易控制、能处理胶体底物和不溶性底物及催化剂更换方便等优点，因而常被用于饮料和食品加工工业，缺点:即催化剂颗粒容易被搅拌桨叶的剪切力所破坏。在连续流搅拌罐的液体出口处设置过滤器，可以把催化剂颗粒保存在反应器内，或直接选用磁性固定化酶，借助磁场吸力固定。此外，可将催化剂颗粒装在用丝网制成的扁平筐内，作为搅拌桨叶及挡板，以改善粒子与流体问的界面阻力，同时也保证了反应器中的酶颗粒不致流失。 2、超滤膜酶反应器（二）固定化酶反应器1、搅拌罐反应器分批反应器连续流搅拌管反应器 2、固定床（填充床）型反应器 把催化剂填充在固定床（填充床）中的反应器叫做固定床型反应器。优点:单位体积的催化剂负荷量高、结构简单、容易放大、剪切力小、催化效率高等，特别适合于存在底物抑制的催化反应缺点：温度和pH值难控制；底物和产物会产生轴向分布易引起相应的酶失活程度也呈轴向分布； 更换部分催化剂相当麻烦；柱内压降相当大，底物必须加压后才能进入。操作方式:一是底物溶液从底部进入而由顶部排出的上升流动方式，另一种则是上进下出的下降流动方式。 3、流化床反应器流化床型反应器是一种装有较小颗粒的垂直塔式反应器。与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，底物以一定的流速从下向上流过，流过固定酶床，因此流速要适当控制。使固定化酶颗粒在流体中维持悬浮状态并进行反应，这时的固定化颗粒和流体可以被看作是均匀的流体。优点:传热与传质特性好、不堵塞、能处理粉状底物、压降较小等，也很适合于需要排气供气的反应，缺点：需要较高的流速才能维持粒子的充分流态化，而且放大较困难。应用：主要被用来处理一些粘度高的液体和颗粒细小的底物，如用于水解牛乳中的蛋白质。4、膜型反应器（膜式反应器）膜式反应器利用膜的分离功能，同时完成反应和分离过程的反应器。这是一类仅适合于生化反应的反应器，包括了用固定化酶膜组装的平板状或螺旋卷型反应器、转盘反应器、空心酶管和中空纤维膜反应器等。平板状和螺旋卷型反应器具有压降小放大容易等优点，但与填充塔相比，反应器内单位体积催化剂的有效面积较小。 空心酶管反应器主要与自动分析仪等组装，用于定量分析。转盘反应器又可细分为立式和卧式两种，主要多于废水处理装置，其中卧式反应器由于液体的上部接触空气可以吸氧，适用于需氧反应。中空纤维反应器则是由数根醋酸纤维素制成的中空纤维构成，其内层紧密光滑，具有一定的分子量截留值，可截留大分子物质，而允许不同的小分子量物质通过；外后则是多孔的海绵状支持层，酶被固定在海绵支持层中。这种反应器不仅能承受68个标准大气压以上的压力而且还具有高的装填密度，具有很好的工业应用前景。5、鼓泡塔型反应器利用从反应器底部通入的气体产生大量气泡，在上升过程中提供底物和混合作用的一类反应器。反应体系中存在固、液、气三相，又称三相流化床反应器。6、喷射式反应器利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应的一种反应器。可能遗漏的知识点补充：二、各种酶反应器的特点反应器类型适用的操作方式适用的酶特点搅拌罐式反应器分批式,流加分批式连续式,游离酶固定化酶反应比较完全，反应条件容易调节控制。填充床式反应器连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。流化床反应器分批式流加分批式连续式固定化酶流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。鼓泡式反应器分批式流加分批式连续式游离酶固定化酶鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。膜反应器连续式游离酶固定化酶清洗比较困难喷射式反应器连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应。二、酶反应器的选择（一）根据酶的应用形式选择反应器1、游离酶反应器的选择（1）游离酶常用的反应器：最常用的反应器是搅拌式反应器。（2）有气体参与的酶反应：通常采用鼓泡式反应器。（3）酶价格高的：为了使酶能够回收利用，可以采用游离酶膜反应器。（4）耐高温的酶：喷射式反应器。2、固定化酶反应器的选择（二）根据酶反应动力学性质选择反应器1、酶与底物的混合程度，搅拌式、流化床式反应器均具有较好的混合效果。2、底物浓度对酶反应速度的影响，酶反应速度随底物浓度的增加而升高。3、产物的影响，反馈抑制。4、酶催化作用的温度条件，某些耐受100摄氏度以上的酶，最好选用喷射式反应器。（三）根据底物或产物的