野生铁皮石斛rDNAITS序列分析.pdf

2012第十四卷第五期 Vol 14 No 5 World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 收稿日期 2011 12 22 修回日期 2012 01 18 科学技术部国家 十二五 科技支撑计划项目 2011BA101B02 珍稀中药材铁皮石斛 GAP 基地优化升级及开发利用研究 负责人 赖小 平 国家自然科学基金项目 81001601 特异性 DNA 探针和特征肽指纹图谱技术在燕窝质量评价中的应用 负责人 赖小平 广东省自然 科学基金博士启动项目 10451040701006101 基于 DNA 条形码技术的蛇蜕药材来源物种鉴定研究 负责人 陈念 通讯作者 赖小平 本刊编委 教授 博导 广州中医药大学中药学院院长兼新药开发研究中心主任 东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院院 长 主要研究方向 中药学 E mail lxp88 野生铁皮石斛 r D N AI T S 序列分析 李海霞黄海波刘鹏黄松张桂芳张丹雁 广州中医药大学中药学院广州510006 张建霞 中国科学院华南植物园广州510560 陈念赖小平 广州中医药大学中药学院广州510006 摘要 目的 测定和分析不同产地野生铁皮石斛样品的 rDNA ITS 序列 探讨利用 ITS 序列推测 铁皮石斛样品产地来源的可行性 方法 提取总基因组 DNA 使用通用引物 ITS5F ITS4R 进行 PCR 扩 增 产物经电泳检测 纯化和测序后用 Sequin 11 0 提交 GenBank 用 Bioedit 7 0 中的 Clustal W 对 GenBank 中包括本研究提交的 11 条在内的所有 33 条铁皮石斛的 ITS 序列进行多重序列比对 随后以 金钗石斛和密花石豆兰为外群 用邻接法构建 NJ 系统发育树 结果 从所有测定的 ITS 序列中选择 11 条提交 GenBank 获得登录号 JF803235 JF803245 所有铁皮石斛经比对后共发现 645 个同源位点 9 个信息位点 ITS1 区 3 个 5 8 S 区 4 个 ITS2 区 2 个 系统发育分析发现 金钗石斛和密花石豆兰位 于树的基部 另外 32 条铁皮石斛共同形成单个大的分支 未发现产地来源与系统树的拓扑结构之间 存在对应关系 结论 由于缺乏完善的铁皮石斛标准品及其 DNA 参考序列的提交标准 同时单个 ITS 序列仅能提供有限的系统发育信息位点 因此通过 ITS 序列分析的方法推测铁皮石斛样品的产地来源 目前尚不具有可行性 关键词 铁皮石斛内转录间隔区系统发育分析物种鉴定 doi 10 3969 j issn 1674 3849 2012 05 018 铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo 为兰科 Orchidaceae 石斛属多年生草本 民间称其 为 救命仙草 列 中华九大仙草 之首 因其含有 多糖 生物碱 蛋白质 氨基酸及微量元素等多种活 性成分 具有增强机体免疫力 抗衰老 抗肿瘤 降 低血糖等功效 可用于胃肠道疾病 白内障 关节 炎 血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病的治疗 铁皮石斛常以枫斗的形式作为药材使用 在加 工炮制的过程中药材的形状 成分均会发生变化 这使得以形态学为主的鉴定方法在实际应用中显 得捉襟见肘 随着铁皮石斛市场价值的提高 混伪 品不断增多 这对中药材物种鉴定技术的更新换代 2044 世界科学技术 中医药现代化 中药研究 World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 提出了更加迫切的要求 基于核酸测序和序列分析 的 DNA 条形码技术的出现 为快速 准确鉴定生物 样品来源物种的身份带来了希望 其中 位于核基 因组的具有多拷贝特征的内转录间隔区 Internal Transcribed Spacer ITS 在植物种间和种内亲缘关 系研究中的应用极具代表性 国内对于石斛属植物的 ITS 序列已进行了大量 的研究 早在 2001 年 丁小余等 1 4 分析了黄草石 斛 铁皮石斛和束花石斛等 20 余种石斛的 ITS 序 列 发现其具有种内保守 种间差异较大的特点 较 适合作为石斛属植物的 DNA 分子鉴定标记 近年 来 利用 ITS 序列对赤水金钗石斛 铁皮石斛及其近 缘种进行了鉴定 发现 ITS1 较 ITS2 多态性更为显 著 5 8 本实验以 31 株野生来源的铁皮石斛为研究 对象 结合 GenBank 中所有登记为铁皮石斛的 ITS 序列进行了同源比对和系统发育分析 旨在了解其 序列特征和碱基变异规律 同时结合 DNA 分子系 统发育树和遗传距离值对利用 ITS 序列推测铁皮石 斛样品产地来源的可行性进行探讨 一 材料和方法 1 材 料 31 株不同产地来源的野生铁皮石斛样品由广 东永生源生物科技有限公司提供 鉴定人为广州中 医药大学中药鉴定教研室黄海波副教授 样品保存 于广州中医药大学标本室 馆藏号 GUCM010016 010046 本实验中所有分析的 ITS 序列及其样品来 源信息参见表 1 2 总基因组 DNA 提取 PCR 扩增和测序 将所有材料用无菌水冲洗干净 晾干后剪碎 于密封袋中硅胶干燥 称取 0 05 g 样品 经液氮研 磨后 用天根 DP305 离心柱型植物基因组 DNA 提 取试剂盒提取总基因组 DNA 随后用真核生物 ITS 序列通用引物 ITS5F 5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3 和 ITS4R 5 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3 以之为模板进行 PCR 扩增 反应 体系总体积为 25 L 10 Buffer 带 Mg2 2 5 L dNTPs 2 5 mM 2 L 上 下 游 引 物 2 5 mM 各 2 L Dye 2 L ddH2O 13 3 L 模板 DNA 1 L Taq 酶 0 2 L PCR 反应条件 94 预变性 5 min 94 变性 1 min 50 退火 1 min 72 延伸 1 5 min 循 环 30 次 每个循环延伸时间增加 3 s 72 延伸补 齐 7 min 反应产物于 4 保存 取 3 L 用 1 琼 脂糖凝胶电泳检测 经 Wizard 试剂盒纯化后送是中 国农业科学院作物科学研究所开放实验室进行双 向测序 3 序列提交和数据分析 ITS 序 列 拼 接 和 校 对 使 用 Codoncode Aligner 3 7 1 去除两端不确定的序列后 用 Bioedit 7 0 中 的 Clustal W 进行多重序列比对 参考所有已知铁 皮石斛的 ITS 序列及相关文献报道 对所有铁皮石 斛 ITS 序列的起止位置进行精确定位和编号 经比 对后发现 广东河源 016 019 号样品序列相同 广 西西林 020 023 序列相同 江西广昌 024 025 序列 相同 026 和 027 序列均不同于前两个 江西会昌 028 031 序列相同 江西井冈山 034 与 032 033 035 序列不同 福建武夷山 036 039 序列相同 福建 冠豸山 040 042 序列相同 云南师宗 043 046 序列 相同 因此选择同产地间互不相同的序列 016 020 024 026 027 028 032 034 036 040 043 共 11 条 序列提交 GenBank 用 MEGA 5 0 中的 Kimura 2 parameter 模型计算遗传距离 以金钗石斛和密花石 豆兰为外群采用邻接法构建 NJ 系统发育树 所有 对位排列结果的空位或缺失数据作完全删除处理 系统树各分支的置信度以自举检验法 bootstrap test 检验 进行 2000 次循环 二 结果和分析 1 序列特征 对包括本研究提交的 11 条在内的所有 33 条铁 皮石斛的 ITS 序列进行比对后发现 ITS1 5 8S ITS2 共包括 645 个同源位点 用 MEGA 5 0 统计得 到保守位点有 574 个 变异位点 62 个 单态位点 53 个 如图 1 所示 9 个信息位点的分布情况为 ITS1 区 3 个 分别位于第 037 082 和 170 位 5 8 S 区 4 个 分别位于 239 357 358 和 372 位 ITS2 区 2 个 分别位于 498 和 549 位 上述 9 个位置是铁皮石斛 ITS 区内部相对变异频率较高的位点 是形成系统 发育树内部各分支的主要原因 但所有这些位点均 未发现存在产地来源的特异性 值得注意的是 5 8 S 区作为蛋白编码基因与 ITS1 2 相比应该更加保守 但如图 1 所示却具有 较多的信息位点 产生这种结果的原因主要在于 AF401490 和 EU592018 出现了 4 个变异位点 见阴 2045 2012第十四卷第五期 Vol 14 No 5 World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 表 1序列数据信息 种类来源地长度编号登录号馆藏号文献 铁皮石斛 Dendrobium officinale 石斛属 广东河源 Heyuan Guangdong636 bpGD HY 016JF803235GUCM010016 本研究 广东韶关 Shaoguan Guangdong635 bpGD SGEF221849XYD03009 9 广东深圳 Shenzhen Guangdong635 bpGD SZAY485692 ICMdoff2103 7 10 广西环江 Huanjiang Guangxi635 bpGX HJEF221850XYD06004 9 广西西林 Xilin Guangxi636 bpGX XL 020JF803236GUCM010020 本研究 广西永福 Yongfu Guangxi636 bpGX YFFJ530945 8 广西乐业 Leye Guangxi636 bpGX LYFJ530944 8 广西西林 Xilin Guangxi 广西天峨 Tiane Guangxi 云南广南 Guangnan Yunnan 贵州三都 Sandou Guizhou 浙江天台 Tiantai Zhejiang 635 bpML1AF311776 XYD99001 XYD99022 XYD99002 XYD99003 XYD06018 2 11 12 浙江天台 Tiantai Zhejiang635 bpZJ TTEF221853XYD04010 9 福建武夷山 Wuyishan Fujian636 bp FJ WYS 036JF803243GUCM010036 本研究 福建冠豸山 Guanzhishan Fujian 636 bpFJ GZS 040JF803244GUCM010040 本研究 福建顺昌 Shunchang Fujian635 bpFJ SCEF221851XYD04008 9 云南师宗 Shizong Yunnan636 bpYN GN 043JF803245GUCM010043 本研究 云南文山 Wenshan Yunnan635 bpYN WSEF221852XYD04009 9 云南广南 Guangnan Yunnan636 bpYN GNFJ588872 8 云南思茅 Simao Yunnan636 bpYN SMFJ588871 8 贵州荔波 01 Libo Guizhou636 bpGZ LB 01FJ530947 8 贵州荔波 02 Libo Guizhou636 bpGZ LB 02FJ384723 8 重庆 Chongqing636 bpCQFJ530946 8 江西广昌 Guangchang Jiangxi635 bpJX GCEF221848XYD05005 9 江西广昌 Guangchang Jiangxi 636 bp 636 bp 636 bp JX GC 024 JX GC 026 JX GC 027 JF803237 JF803238 JF803239 GUCM010024 GUCM010026 GUCM010027 本研究 江西会昌 Huichang Jiangxi636 bpJX HC 028JF803240GUCM010028 本研究 江 西 井 冈 山 Jinggangshan Jiangxi 636 bp 636 bp JX JGS 032 JX JGS 034 JF803241 JF803242 GUCM010032 GUCM010034 本研究 江西上饶 Shangrao Jiangxi 广西桂林 Guilin Guangxi 635 bpML2EF221854 XYD05006 XYD05009 9 未知637 bpNAEU592018 未知636 bpNAGU339109 未知628 bpNAAF401490 未知640 bpNAFJ428218 未知636 bpNAFJ384724 未知636 bpNAFJ588873 金钗石斛 Dendrobium nobile 石斛属 外群 四川夹江 Jiajiang Sichuan636 bpSC JJFJ378649 8 密花石豆兰 Bulbophyllum odoratissimum 石豆兰属 外群 四川万源 Wanyuan Sichuan644 bpSC WYFJ428222 8 注 编号中 ML 表示多个产地 NA 表示 6 份样品的产地来源未知 馆藏号中 表示无馆藏号 2046 世界科学技术 中医药现代化 中药研究 World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 影部分 虽然这 2 条序列均记载来自铁皮石斛 但 所有信息位点与金钗石斛 SC JJ FJ378649 几乎完 全一致 表明这 2 个样品可能就是金钗石斛 2 遗传距离 从所有 33 条铁皮石斛 ITS 序列中选择产地来 源明确的 27 条进行遗传距离分析 如表 2 所示 对 角线上方的数据为对应的遗传距离值的标准偏差 最大值为 0 006 遗传距离值为 0 000 保留到小数 点后第 3 位 的区域用阴影表示 分别对应于图 1 中的 3 个实线框 代表两两间的序列极为相似甚至 完全一致 然而 这些序列所对应的样品却分别来 自多个不同的产地 且相互重叠 未发现遗传距离 值与产地之间存在对应关系 另外 来自广东深圳 的样品的 ITS 序列 AY485692 与其他铁皮石斛序 列间的遗传距离 0 019 0 024 明显大于其他 ITS 序列内部之间的遗传距离 0 000 0 010 3 系统发育树 邻接法构建的系统发育树如图 1 所示 其中金 钗石斛和密花石豆兰作为外群位于树的基部 其 他绝大部分铁皮石斛共同形成了单个大的分支 支 持值为 99 在该分支内部包括了 2 个主要的分支 和 两者的 bootstrap 支持值分别为 52 和 58 均小于 70 说明其内部的分支关系可靠性较低 在 分支 的内部 来自福建武夷山 FJ WYS 036 和 广西环江 GX HJ 的 2 条 ITS 序列的信息位点完 全相同 分支支持值为 88 说明两者的亲缘关系 极为接近 从系统发育树看 来自广西 6 个 云南 5 图 1实验样品的 NJ 树和信息位点 2047 2012第十四卷第五期 Vol 14 No 5 World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 个 贵州 2 个 浙江 2 个 重庆 1 个 的样品均 位于分支 其余 3 个省份的样品则位于不同的分 支 这说明利用基于 ITS 序列构建的 NJ 系统发育树 仍然无法实现对上述 33 份铁皮石斛样品的产地来 源进行鉴定 三 讨论和结论 本研究测定了 31 株不同产地来源的珍贵野生 铁皮石斛的 ITS 序列 在去除同一产地来源完全一 致的序列后 将余下的 11 条序列提交 GenBank 同 时对 GenBank 中所有已经提交的 22 条登记为铁皮 石斛的 ITS 序列进行了文献考证 并结合上述所有 已提交的 33 条序列从序列特征 遗传距离和系统 发育关系 3 个方面进行了综合性的分析 以探讨利 用 ITS 序列推测铁皮石斛样品产地来源的可行性 结果表明 在现阶段 该方法尚无法用于铁皮石斛 来源产地的鉴定 究其原因有 一方面 基于 DNA 序列的物种鉴定方法 首先要求建立参考物种的综 合信息数据库 即对来源身份明确的标准样品进行 登记和 DNA 序列的测定 基于 GenBank 上已知的 22 条铁皮石斛的 ITS 序列进行文献考证发现 有 6 条序列的产地无法确认 甚至大部分文献均未对其 来源到底是野生还是栽培进行明确的说明 严格说 来 仅野生种的遗传信息才有可能与其产地之间存 在相关性 异地引种来的栽培种或杂交种并不具有 代表性 另一方面 传统观点认为 来自 道地产区 的药材质量是最好的 因为它的自然环境最有利于 药材有效成分的积累 这里的环境因素涉及温度 光照 水分 土壤 气候等 它们对于药材活性成分 等生理因素的影响较为明显 但对于药材自身遗传 信息的影响在短时间内则极为有限 只有在特定的 环境下经过长期的进化才可能形成自身独特的基 因型或生态型 因此 不考虑样品来源信息的可靠 性对分析结果的影响 仅利用 省 市 地区 等 人为划定的区域来定义药材的 产地 是不可能与 自然界复杂的环境条件 以及物种的遗传信息之间 建立关联的 此外 为了实现对药材商品来源产地 的准确 追溯 还必须借助其他信息学技术 不排 除利用 DNA 信息的可能性 致谢 感谢中国医学科学院药用植物研究所宋 经元博士和姚辉博士为本文提供实验条件和指导 参考文献 1徐红 李晓波 丁小余 等 中药黄草石斛 rDNA ITS 序列分析 药学学报 2001 36 10 777 783 2丁小余 王峥涛 徐红 等 枫斗类石斛 rDNA ITS 区的全序列数 据库及其序列分析鉴别 药学学报 2002 37 7 567 573 3丁小余 王峥涛 徐珞珊 等 F 型 H 型居群的铁皮石斛 rDNA ITS 区序列差异及 SNP 现象的研究 中国中药杂志 2002 27 2 85 89 4丁小余 徐珞珊 王峥涛 等 束花石斛及其相似种的 DNA 分子 鉴别 中国中药杂志 2002 27 6 407 411 5葛晓军 肖鲲 李小琼 等 赤水金钗石斛 rDNA ITS 序列分析 江苏大学学报 2008 18 6 510 512 6顾慧芬 庄意丽 马子建 等 基于 ITS 序列分析铁皮石斛与近 缘类群的亲缘关系 中成药 2010 32 4 628 632 7周倩 蒋贤慧 杨晶晶 等 浙江乐清铁皮石斛 rDNAITS 序列的 克隆及序列比对 基因组学与应用生物学 2010 29 3 513 517 表 2遗传距离值表 2048 世界科学技术 中医药现代化 中药研究 World Science and Technology Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 8刘静 何涛 淳泽 等 基于 ITS 序列的中国药用石斛及其混伪 品的分子鉴定 中国中药杂志 2009 34 22 2853 2856 9Ding G Zhang DZ Feng ZY et al SNP ARMS and SSH authen tication of medicinal Dendrobium officinale KIMURA et MIGO and application for identification of Fengdou drugs Biol Pharm Bull 2008 31 4 553 557 10 Zhang YB Wang J Wang ZT et al DNA Microarray for identifi cation of Herba Dendrobium from Chinese Medicinal Formulations Planta Med 2003 69 1172 1174 11 丁小余 徐珞珊 徐红 等 曲茎石斛及其近似种鉴别的形态和 DNA 分子证据 药学学报 2001 36 11 868 873 12 Zhang WC Ding XY Xie ML et al Authentication of three valu able Dendrobium species by adapter ligation mediated allele spe cific amplification Eur Food Res Technol 2009 229 1 7 Analysis of rDNA ITS Sequence of Wild Dendrobium Officinale Li Haixia1 Huang Haibo1 Liu Peng1 Huang Song1 Zhang Guifang1 Zhang Danyan1 Zhang Jianxia2 Chen Nian1 Lai Xiaoping1 1 School of Chinese Materia Medica Guangzhou University of Chinese Medicine Guangzhou 510006 China 2 South China Botanical Garden Chinese Academy of Sciences Guangzhou 510560 China Abstract This study was aimed to determine the sequence and analyze rDNA ITS sequences of samples of wild Dendrobium officinale from different origins The feasibility of using ITS sequence to identify the origin of Den drobium officinale was discussed Total DNA was extracted and PCR was applied by using primer ITS5F ITS4R Then the PCR products are electrophoresised purified sequenced and submitted to GenBank Clustal W was used to compare the multiple alignment of all 33 ITS sequences including 11 submitted sequen