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6 生物信息学论文 基因芯片综述 Gene chip review 引言 Introdaction 随着人类基因组（测序）计划（ Human genome project ）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而 , 怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。1998 年底美国科学促进会将基因芯片技术列为 1998 年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。现在，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。 摘要 Summary基因芯片根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片 等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，基因芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、分子反应和信号的检测。早在八十年代， Bains W. 等人 就将短的 DNA 片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。 关键词 Keyword 探针、碱基互补、信号检测 、 高通量、灵敏 正文 TEXT一、定义：基因芯片是把已知序列信息的探针分子固定于特定的载体上用碱基杂交互补的原理去检测未知基因序列信息的一组基因微阵列。它的出现是20世纪90年代计算机和基因测序技术发展到一定程度相结合而产生的一种生物技术。它能够平行，高通量，微型化、自动化地检测成千上万未知基因序列的特点。二、分类：1 固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2 用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3 在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。3、 发展史：俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室（ANL）的科学家们最早在文献中提出了用杂交法测定核酸序列（SBH）新技术的想法。当时用的是多聚寡核酸探针。几乎与此同时英国牛津大学生化系的Sourthern等也取得了在载体固定寡核苷酸及杂交法测序的国际专利。994年在美国能源部防御研究计划署、俄罗斯科学院和俄罗斯人类基因组计划1000多万美元的资助下研制出了一种生物芯片，并用于检测尽地中海病人血样的基因突变，筛选了一百多个外地中海贫血已知的突变基因。4、 原理：其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息。制作与检测：1、芯片制备目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。2、样品制备生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。3、杂交反应杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。4、信号检测和结果分析杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统或称缩微芯片实验室。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。5、 相关技术：（1）载体材料 芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜,其中以玻片最为常用。为保证探针稳定固定于载体表面,需要对载体表面进行多聚赖氨酸修饰、醛基修饰、氨基修饰、巯基修饰、琼脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使载体形成具有生物特异性的亲和表面。最后将制备好的探针固定到活化基片上,（2）检测 荧光标记杂交信号的检测方法 、激光扫描荧光显微镜、激光扫描共焦显微镜、 CCD相机的荧光显微镜、生物素标记方法中的杂交信号探、光纤传感器。6、 发展前景：（1）应用 在基因表达检测的研究上人们已用该技术（共 157,112 个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异 。在实际应用方面，基因芯片技术可广泛应用于以下方面：药物筛选和新药开发 省略大量的动物试验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。疾病诊断上 快速有效。在环境保护 一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。司法鉴定 可以建立全国甚至全世界的DNA指纹库以尽快、准确的破案。现代农业 可以用来筛选农作物的基因突变等。它的研究范围包括了基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变和多态性分析以及基因文库作图以及等方面。（2）难题 基因改变与疾病的关系并不能一一对应，所有基因检测的结果，并非一定就会发生。同样，即使你检测出来携带耳聋基因，也并不意味一定会出现药毒性耳聋。基因芯片还不能完全取代目前临床实验室诊断，”海归的基因检测创业者认为，当前这个阶段应该客观地看待基因芯片技术，但是，“谁也不能否认它的医学参考价值”。尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。7、 数据分析与处理：（一）数据的预处理 提取、对数化理、过滤、补缺、数据标准化 。（二）数据的差异表达分析 倍数法、t检