EB染色液的配置.doc

EB染色液的配置观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA条带。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。如果你经常做电泳的话，推荐你用GoldViewGoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。由于未发现GoldView有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Goldview代替EB不失为一种明智的选择。使用方法1. 将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%2%）在微波炉中融化。2. 加入5µl GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。3. 冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。4. 电泳完毕在紫外灯下观察。若使用数码相机照相记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。注意事项1. 胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。2. 加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。3. 通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。4. 虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。我是跑完电泳后把琼脂糖凝胶放入EB中进行染色,请问EB是用蒸馏水配制吗？ EB 溴化乙锭 ethylene dibromide,一般是配成10mg/ml的贮存液1. 首先配比EB储液 的时候,一般是配成浓度为10mg/ml.10mg/ml EB 溴化乙锭配法：溴化乙锭 200mg双蒸水20ml充分搅拌使之完全溶解至澄清红色,分装,4保存。2. 掺入琼脂糖凝胶和缓冲液的浓度为0.5ug/ml,具体用量根据你的胶来决定.当加热溶解琼脂糖后,就可以加入EB,100ml大概3微升左右就够了,我一般是加的2.4微升.3. 如果是跑完胶浸泡的话相应的要提高加入的量,看到胶略显红色就可以了. 一般10-20分钟,胶用水冲洗一下就可以了。泡过胶的EB液可以用活性炭处理一下,就可以从水管倒掉,很安全。国外的都这么做的注意：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性,使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套,称量染料时要戴面罩 3. 如果是跑完胶浸泡的话相应的要提高加入的量,看到胶略显红色就可以了. 一般10-20分钟,胶用水冲洗一下就可以了。泡过胶的EB液可以用活性炭处理一下,就可以从水管倒掉,很安全。国外的都这么做的这时是用蒸馏水配EB吗？ 是啊,其实用去离子水也可以的,不要求无菌的。 EB应该能反复泡胶的吧,不用每次都要现配的吧？ 可以反复泡胶的,但是EB有挥发性,你泡完后必须密封保存的,否则可能有害于身体的。 泡胶的EB浓度要多少啊？急啊,谢谢！ 和加入凝胶中的终浓度是一样的,0.5ug/ml。 为啥要泡呢？直接点到胶里不是更安全些吗？效果不一样吗？ 1mg/ml水 配置EB溶液 每次胶冷至55-60度 按每5ul/10ml胶