病理科论文病理学论文病理技术论文：去瓣型Epi-LASIK和PRK对兔角膜病理影响的对比研究.doc

病理科论文病理学论文病理技术论文：去瓣型Epi-LASIK和PRK对兔角膜病理影响的对比研究【摘 要】目的对比研究去瓣型准分子激光上皮下角膜磨镶术(epi-polis laser in-situ keratomileusis, Epi-LASIK)和准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy, PRK)对兔角膜病理的影响。方法新西兰白兔34只,随机取其中32只兔的右眼行去瓣型Epi-LASIK(A组),左眼行PRK(B组),另外2只兔(4只未手术眼)为正常对照组(C组)。术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、1个月、3个月取角膜标本,HE染色观察角膜前基质细胞的数量变化,免疫细胞化学染色观察角膜中央区Ki-67、-SMA阳性细胞数量及角膜切削缘区PCNA阳性细胞数量,同时透射电镜观察角膜超微结构的变化。结果正常角膜前基质细胞数量为每400倍光镜(88. 005. 38)个;术后各时间点B组前基质细胞数量均较A组少,差异均有显著统计学意义(均为P001)。正常角膜上皮细胞基底层PCNA阳性细胞数量为每400倍光镜(15. 943. 02)个;术后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d A组PC-NA阳性细胞数量均较B组少,差异均有统计学意义(均为P0. 05或0. 01)。正常角膜基质层几乎不表达Ki-67;术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d A组Ki-67阳性细胞数均较B组少,差异均有显著统计学意义(均为P0. 01)。正常角膜几乎不表达-SMA;术后5 d、7 d、14 d、1个月、3个月A组-SMA阳性细胞数均较B组少,差异均有显著统计学意义(均为P0. 01)。透射电镜检查显示,术后7 d之内A组细胞之间结合更紧密, 3个月时基质内胶原纤维排列较整齐。结论去瓣型Epi-LASIK比PRK有着更轻的角膜上皮损伤反应,更少的角膜上皮细胞和角膜基质细胞增殖反应以及更低的向肌成纤维母细胞转化潜能,所以角膜上皮下雾状混浊(haze)发生的可能性更低。【关键词】 准分子激光屈光性角膜切削术;去瓣型准分子激光上皮下角膜磨镶术;角膜病理1988年,Marshall等1发明了准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy, PRK),这是第一种用于临床的准分子激光屈光手术术式。2001年,为防止酒精浸泡破坏上皮细胞基底膜和前弹力层的完整性, Pallikaris等又提出了机械法准分子激光上皮下角膜磨镶术(epi-polis laser in-situ ker-atomileusis,Epi-LASIK)2。PRK和Epi-LASIK都没有保留角膜前弹力层,但术后角膜上皮下雾状混浊(haze)的发生率PRK远高于Epi-LASIK3-4。临床发现,Epi-LASIK去瓣后虽然和PRK同样没有上皮瓣,但前者上皮生长更快,反应更轻, haze发生率更低,为此,我们采用光镜、电镜和免疫细胞化学染色对PRK和去瓣型Epi-LASIK术后的角膜病理和超微结构、增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear anti-gen,PCNA)阳性细胞、增殖蛋白Ki-67阳性细胞、-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)阳性细胞等进行研究,希望对造成2种术式间haze发生率差异的病理原因做深入探讨,为准分子激光屈光手术方法的选择提供病理学依据。1材料与方法1. 1材料1. 1. 1实验动物健康新西兰白兔34只(南昌大学医学院动物实验部提供),月龄34个月,体质量2.02. 5 kg,雌雄兼有,术前用裂隙灯显微镜检查以排除眼前段炎性病变及角膜混浊,用Schi tz眼压计测量眼压以排除异常眼压。1. 1. 2主要试剂二氨基联苯胺(diaminobenzidin,DAB)显色剂、小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体、小鼠抗人Ki-67、-SMA单克隆抗体与山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1. 1. 3实验仪器鹰视蓝调酷眼ALLEGRETTOEYE-Q 1010-2准分子激光治疗仪(德国WaveLightLaserTechnologicAG公司), LSK-One微型角膜上皮刀(法国Moria公司),透射电镜H-600(日本Hitachi公司)。1. 2实验分组与实验方法1. 2. 1实验分组随机取32只兔右眼行去瓣型Epi-LASIK,设为A组;左眼行PRK,设为B组,同样参数(-6 D)行准分子激光切削。另外2只兔(4只未手术眼)为正常对照组,设为C组。将A、B组再随机平均分为术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、1个月、3个月组,每组4眼。1. 2. 2手术方法术前30 gL-1戊巴比妥钠耳缘静脉注射全身麻醉(1 mLkg-1体质量),术时滴用5 gL-1盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉,每5 min滴眼1次,共3次。A组:钢丝开睑器开睑,LSK-One微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,去除上皮瓣,范围7mm,行光学区6 mm、屈光度数-6 D的准分子激光切削。B组:钢丝开睑器开睑,体积分数20%酒精浸泡中央角膜上皮20 s,用角膜上皮铲由周边向中心机械刮除松动的角膜上皮,范围7 mm,行光学区6mm、屈光度数-6 D的准分子激光切削。术毕戴软性亲水角膜接触镜,睑缘1/3间断缝合2针,术后滴诺氟沙星眼液,每天4次。A、B组32只兔分别于术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、1个月、3个月空气栓塞法处死并取角膜标本。每个时间点分别将3个角膜常规石蜡包埋切片行HE染色及Ki-67、-SMA、PCNA免疫细胞化学染色; 1个角膜行透射电镜检查。同法处理C组4只空白对照眼。1. 2. 3HE染色角膜标本用40 gL-1中性甲醛溶液固定,常规脱水、渗透、石蜡包埋,连续切片,厚约4m,常规HE染色,400倍光镜视野下计数角膜中央区前基质细胞数量,随机观察6个视野,取其均值。1. 2. 4免疫细胞化学Ki-67、-SMA、PCNA均采用PV-6002二步法免疫细胞化学检测试剂。脱蜡、水化组织切片。体积分数3%H2O2去离子水孵育10 min,PBS冲洗。滴加各自所需的一抗(小鼠抗人Ki-67单克隆抗体、小鼠抗人-SMA单克隆抗体、小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体), 37孵育2 h,PBS冲洗,2 min3次。滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体, 37孵育30 min, PBS冲洗, 2 min3次。选用DAB显色。蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片,400倍光镜视野下观察角膜中央区Ki-67、-SMA阳性细胞及角膜切削缘区PCNA阳性细胞,随机取6个视野,分别记录阳性细胞数,计算平均值。1. 2. 5透射电镜检查离体的角膜切割成1 mm1 mm1 mm小块,置入25 gL-1戊二醛中前固定24 h,以0. 1 molL-1PBS(pH 7. 40)清洗并浸入10gL-1锇酸中后固定2 h, PBS冲洗3次,丙酮梯度脱水。在丙酮与包埋剂(Epon. 812)混合液中浸透与包埋,半薄切片定位。制超薄切片,醋酸铀柠檬酸铅双重染色,在透射电镜下观察角膜上皮细胞形态变化并照相。1. 3统计学分析采用SPSS 13. 0统计学软件包,用两样本均数t检验,单因素样本方差分析(One-WayANOVA)SNK、Dunnettss C-t检验进行统计学处理,P0. 05为差异有统计学意义。2结果2. 1前基质细胞数量正常角膜(C组)前基质细胞数量为每400倍光镜(88. 005. 38)个。术后各时间点A、B组平均前基质细胞数量见表1。术后各时间点A、B组前基质细胞数量均较C组少,差异均有统计学意义(均为P005);术后各时间点A组前基质细胞数量均较B组多,差异均有显著统计学意义(均为P0. 05);术后各时间点B组PCNA阳性细胞数量均较C组多,差异均有统计学意义(均为P0. 05)。术后1 d、3 d、5 d、7 d、14 dA组PCNA阳性细胞数量均较B组少,差异均有统计学意义(均为P005或0. 01)。2. 3K i-67阳性细胞数量正常角膜(C组)基质层几乎不表达Ki-67,Ki-67阳性细胞数量为0。术后各时间点A、B组平均Ki-67阳性细胞数量见表3。术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 dA、B组Ki-67阳性细胞数均较C组多,差异均有统计学意义(均为P005)。术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d A组Ki-67阳性细胞数均较B组少,差异均有显著统计学意义(均为P0. 01)。2. 4-SMA阳性细胞数量正常角膜(C组)几乎不表达-SMA,-SMA阳性细胞数量为0。术后各时间点A、B组平均-SMA阳性细胞数量见表4。术后5 d、7 d、14 d、1个月、3个月A、B组-SMA阳性细胞数量均较C组多,差异均有统计学意义(均为P005)。术后5 d、7 d、14 d、1个月、3个月A组-SMA阳性细胞数均较B组少,差异均有显著统计学意义(均为P0. 01)。2. 5透射电镜观察2.5. 1C组角膜上皮为35层未角化的复层扁平上皮,表面为12层扁平细胞,其下是12层翼状细胞,基底为1层柱状细胞,各层细胞排列规则(图1)。基底细胞可见较多的半桥粒,基底膜连续,前弹力层菲薄,不连续。基质层胶原纤维排列整齐,成纤维细胞呈长椭圆型,可见少量线粒体、粗面内质网(图2)。2. 5. 2B组术后4 h,大量角膜前基质细胞皱缩变圆,核形不规则,染色质固缩聚于核膜周边,线粒体基本正常,粗面内质网膨大,胞膜完整,可见出泡现象和凋亡小体形成,呈典型细胞凋亡特征(图3);术后1d,角膜上皮细胞1层覆盖切削区,基底细胞呈斜柱状、扁平状,成纤维细胞体积未见增大,胶原纤维排列轻微紊乱(图4);术后3 d,角膜上皮细胞1层或2层覆盖切削区,角膜前基质胶原纤维排列紊乱,深层基质胶原纤维排列较整齐;术后5 d,角膜上皮细胞3层或4层覆盖切削区;术后7 d,角膜上皮细胞4层或5层覆盖切削区,上皮基底膜与基质交界处略显疏松,胶原纤维排列紊乱;术后14 d,上皮基底细胞的半桥粒稀疏,基底膜薄且不连续;术后1个月,角膜上皮细胞增至68层,上皮细胞体积增大,细胞内游离核糖体增多,成纤维细胞体积增大,胶原纤维排列异常紊乱;术后3个月,角膜上皮细胞基本恢复正常,基底膜不连续、不规则,半桥粒数目较少,成纤维细胞体积肥大,内质网池显著扩张,线粒体数量增加,胶原纤维排列较前整齐。2. 5. 3A组术后4 h7 d基本和B组相同,但细胞之间结合更紧密(图5-图7);术后1个月,上皮细胞形态基本正常,其胞核体积增大,半桥粒数目未减少,基质内胶原纤维排列轻微紊乱,成纤维细胞体积显著增大,细胞内线粒体数量增加,内质网池扩张;术后3个月,成纤维细胞形态及细胞器基本恢复正常,胶原纤维排列较整齐(图8)。3讨论Ghanem等4报道PRK术后1个月时haze的发生率为86%,术后3个月时仍高达84%。Mohan等5甚至报道用兔角膜行PRK术后1个月时haze的发生率为100%。Long等6报道Epi-LASIK术后1个月时haze的发生率为40%,术后3个月时降为10%。Pallikaris等7报道Epi-LASIK术后3个月时haze的发生率为3%。PRK和Epi-LASIK术后haze发生率的差异如此之大,我们可以从haze形成的几个重要影响因素进行分析。3. 1角膜基质细胞凋亡角膜基质细胞的凋亡诱发胶原沉积和胶原解体,是角膜损伤后haze形成的始动因素。角膜基质细胞的凋亡主要局限于前基质层5070m的区域8-9。因此,我们在400倍光镜下对PRK和去瓣型Epi-LASIK术后各个时间点的角膜中央区前基质细胞计数,并与正常角膜做对照来判断2种手术术后角膜基质细胞凋亡的差异。前基质细胞数量越少,说明角膜基质细胞凋亡越多,对haze的形成越有利。本研究结果表明, PRK和去瓣型Epi-LASIK术后前基质细胞数量均有明显的减少,各时间点PRK组前基质细胞数量均较去瓣型Epi-LASIK组少,差异均有显著统计学意义(均为P001)。造成上述差异的一个可能重要原因是,角膜损伤后白细胞介素-1和转化生长因子-等信号分子在肌成纤维细胞转化和伤口收缩等方面起重要作用,而PRK术后角膜上皮细胞基底膜不完整,减弱了来自角膜上皮或泪液中的信号分子如白细胞介素-1和转化生长因子-等对角膜刺激的屏障作用8, 10。3. 2角膜上皮细胞增殖角膜屈光术后细胞增殖是角膜伤口愈合的必要条件,其主要包括上皮细胞和角膜基质细胞的增殖。通过各种细胞因子和生长因子的高水平释放,刺激细胞增殖和抑制角膜上皮细胞的分化,可能会促进haze的形成和屈光回退9, 11。PC-NA是一种不含组蛋白的核蛋白,其作为DNA聚合酶的辅助因子,在细胞周期G1期合成, S期达高峰, S期早期分布于细胞浆内(细胞核缺乏), S期晚期主要存在于细胞核内,与细胞循环有关,一般在细胞增殖期表达,也称细胞周期蛋白,所以PCNA被作为表达细胞增殖活性的标志11。我们的研究发现,术后1d、3 d、5 d、7 d、14 d,PRK组PCNA阳性细胞数量均较去瓣型Epi-LASIK组多,差异均有统计学意义(均为P0. 05),说明PRK的细胞增殖更多,更易造成haze。3. 3角膜基质细胞增殖角膜上皮损伤后数小时,角膜基质细胞开始出现增殖和移行,这进一步促成了肌成纤维细胞的分化和移行,而增殖蛋白Ki-67是细胞G1-M期的标志蛋白,可以标记角膜基质细胞的增殖情况11-13,因此不管是反映角膜上皮的损伤程度还是向肌成纤维细胞转化的潜力,Ki-67阳性细胞数量都是预测haze的一个重要指标。我们的研究发现,术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d,Epi-LASIK、PRK组Ki-67阳性细胞数量均较正常组多,差异均有统计学意义(均为P0. 05); PRK组Ki-67阳性细胞数量均较去瓣型Epi-LASIK组多,差异均有显著统计学意义(均为P0. 01),这说明PRK具有比去瓣型Epi-LASIK更重的角膜上皮损伤反应和更高的haze发生可能性。3. 4肌成纤维母细胞增殖基质层表面不规则导致的角膜上皮基底膜的结构性和功能性损伤使得角膜基质细胞向肌成纤维母细胞演变,进而向肌成纤维细胞转化,而肌成纤维细胞是haze形成的主要细胞因素,-SMA则是肌成纤维细胞细胞骨架的标志蛋白14-16。因此,-SMA也是反映haze发生可能性的重要指标。从我们的研究来看,术后5 d、7 d、14 d、1个月、3个月去瓣型Epi-LASIK、PRK组-SMA阳性细胞数量均较空白对照组多,差异均有统计学意义(均为P0. 05); PRK组-SMA阳性细胞数量均较去瓣型Epi-LASIK组多,差异均有显著统计学意义(均为P0. 01)。这充分证实了PRK比去瓣型Epi-LASIK术后向肌成纤维细胞的转化更活跃,从而造成haze的发生可能性更高。3. 5角膜超微结构改变从透射电镜的结果来看,PRK和去瓣型Epi-LASIK术后7 d之内,去瓣型Epi-LASIK组细胞之间结合更紧密, 1个月、3个月时基质内胶原纤维排列更整齐,而大量排列混乱的胶原纤维正是角膜haze形成的一个重要的直接原因8,因此这也直接证明去瓣型Epi-LASIK术后haze的程度更轻。总之,本研究结果显示出去瓣型Epi-LASIK比PRK有着更轻的角膜上皮损伤反应,更少的角膜上皮细胞和角膜基质细胞的增殖、分化、移行以及更低的向肌成纤维母细胞转化的潜能,从而haze的发生可能性更低。参考文献1Marshall J, Trokel SL, Rothery S, Krueger RR. 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