铜与朊蛋白疾病.doc

铜与朊蛋白疾病相关研究 铜是人体必需的微量元素之一，在体内除参与构成铜蓝蛋白（cp）外，还是多种重要代谢酶的辅助因子，对维持神经系统的正常结构和生理功能起重要作用。遗传或环境因素所致的铜在体内蓄积或缺乏均会导致神经系统铜代谢相关酶和蛋白质的功能紊乱，引起神经细胞功能紊乱，并可导致大脑皮质神经细胞变性坏死，神经细胞减少、退行性病变及神经胶质细胞增生。 铜缺乏会导致结缔组织中胶原交联障碍以及贫血、白细胞减少、动脉壁弹性减弱及神经系统症状等。有报道认为铜缺乏可导致脑组织萎缩、灰质与白质变性、神经细胞减少、神经轴索变性，出现精神发育停滞、嗜睡、运动障碍等症状。虽然铜对人的健康至关重要，但是当铜摄取过多或由于遗传因素（如wilson病等）导致铜在体内蓄积，引起细胞膜损伤、血红蛋白变性和部分酶的活性受抑制，造成溶血性贫血、肝硬化坏死和肾衰竭、中枢神经细胞功能障碍。 另一方面，朊蛋白是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的无免疫性疏水蛋白质。目前对于朊病毒疾病比较公认的致病机制是正常的富含螺旋细胞型朊蛋白(PrPc)构象发生转变,形成富含折叠片层结构并具有蛋白酶抗性的感染型朊蛋白(PrPSc)聚集。 许多证据证明大脑中淀粉样蛋白沉积与朊病毒疾病有关。有研究已经利用重组的PrP得到淀粉样纤维。除了淀粉样纤维聚集外,天然细胞型PrPc还能转变成为一种稳定的富含折叠结构的寡聚体形态,并且这种来自于PrPSc的非纤维状的寡聚体具有较强的毒性。近年的证据表明可溶性寡聚体在神经退行性疾病中造成细胞功能的损伤。 已有的实验表明PrP能够特异地和铜离子结合并在体内可能作为一种铜离子结合蛋白存在。其中四个组氨酸残基结合位点位于60到91位的氨基酸残基区域,而最近的研究表明第96和111位的组氨酸残基也在PrP与铜离子结合过程中起到重要作用。研究结果发现铜离子是PrP寡聚过程中的关键因子。圆二色谱以及外源荧光实验结果揭示在弱酸性条件下铜离子促进的了PrP向富含折叠的结构发生转变,而在偏中性条件下铜离子促进PrP形成无定型沉淀。通过分子筛色谱分离得到了PrP可溶性寡聚体并且利用原子力显微镜观察了寡聚体的大小及形态。寡聚体的平均直径为397nm。MTT实验和流式细胞术显示PrP的可溶性寡聚体对神经瘤母细胞SK-N-SH具有较强毒性并能诱导使其发生凋亡。荧光共聚焦显微镜显示PrP的可溶性寡聚体能够导致细胞内生的PrP发生聚集并转运到溶酶体中,并可能由此引发细胞凋亡信号。这些结果证明在生理酸性环境中,铜离子能够促进PrP形成具细胞毒性的可溶性寡聚体,并诱使神经细胞发生凋亡。 此外,铜离子还对PrP淀粉样纤维的形成起到调节作用。在接近生理的温和实验条件下,铜离子抑制了PrP淀粉样纤维的形成。光散射实验表明在铜离子参与情况下,PrP能够更快的形成较大颗粒的聚集。而ThT实验显示只有在pH7.0的中性环境中没有铜离子参与的条件下,PrP能够形成淀粉样纤维。铜离子的存在抑制了该条件下PrP纤维的形成。而在弱酸性条件下ThT荧光没有升高,表明没有淀粉样纤维形成。利用原子力显微镜观察了PrP纤维样聚集,其直径大约15nm,长度为300nm左右。 通过以上的研究,我们证明铜离子在PrP的聚集过程中起到重要作用。一方面铜离子能够促进PrP形成神经毒性的可溶性寡聚体,另一方面铜离子又能抑制体外典型PrP淀粉样纤维的形成。研究结果提示铜离子可能在朊病毒疾病不同的病理过程中发挥不同的作用。 Scripps研究所的科学家，在新研究中，让突变小鼠和正常小鼠都被感染小鼠scrapie，这会使小鼠患上与疯牛病类似的海绵状脑病。对照小鼠在160天内就会发病，而缺乏铜离子转运基因的突变小鼠直到180天后才发病，于是在Proceedings of the National Academy of Sciences杂志上提出减少机体内的铜离子能够延缓朊蛋白病的发生。然而，研究人员们强调这一研究并不提倡将去除铜离子作为治疗手段，至少不能单独使用这种方法。 清华大学选用胰岛淀粉样蛋白和朊蛋白片段106-126作为淀粉样蛋白聚集机理研究的模型。对于胰岛淀粉样蛋白，通过原子力显微镜和微秒力显微镜发现胰岛淀粉样蛋白能够在五氧化二钽表面形成环状聚集体，并推断出环状聚集体的生长模型。通过进一步研究胰岛淀粉样蛋白及其衍生物的碳末端基团对它们的性质的影响，发现碳末端酰胺化的天然胰岛淀粉样蛋白与碳末端未酰胺化的胰岛淀粉样蛋白衍生物在聚集速度、聚集体构成、细胞毒性等方面存在明显差异。天然的胰岛淀粉样蛋白能迅速发生聚集，跨越有毒的寡聚体状态。而未酰胺化的胰岛淀粉样蛋白衍生物初始聚集速度较慢，在有毒的寡聚体状态持续时间较长，并最终生成-折叠含量较高的纤维状聚集体。这些差异可能是由于蛋白在疏水核心区、构象等方面的差异导致的。通过计算机分子动力学模拟验证了上述的结果。对于朊蛋白片段106-126，通过原子力显微镜发现随着孵育时间的增长，蛋白能够形成非常密集的网膜状结构。推断正是这些网膜状结构侵占正常神经元生长的空间，从而导致神经元损伤。基于淀粉样蛋白聚集机理的基础性研究工作，选用-淀粉样蛋白A1-40作为蛋白模型，设计并合成出由硫代黄素T衍生出来的小分子抑制剂。该小分子抑制剂可以抑制淀粉样蛋白