Taq酶提取protocal.doc

Rapid Purification of High-activity Taq DNA Polymerase本次试验历时六天，分为准备工作（两天），酶的诱导表达（一天），酶的提取（一天），酶的透析以及酶的保存（两天）。下面按时间顺序叙述。第一天 准备工作（1）清洗器皿。100ml量筒：34个1000ml量筒：12个500ml量筒：23个250ml量筒：1个（没有亦可）1000ml烧杯：2个小烧杯：2个500ml三角瓶：1个150ml三角瓶：23个500ml离心管：4个250ml离心管：2or4个50ml离心管：12or6个10ml移液管：56个药勺：34个透析袋+超纯水（灭菌）透析夹+超纯水（灭菌）细菌滤+滤膜（灭菌，切勿烤干！）枪头（1ml12盒，0.2ml2盒） 小管（1.5ml1瓶，灭菌）定性滤纸：两包新的10ml离心管：灭菌，保存酶用。磁转子：蒸馏水洗，不必灭菌。同时准备一大瓶超纯水备用。Note：（一）整个清洗过程都要戴手套（干燥后操作要戴PE手套）。（二）器皿最后都要用超纯水润洗，倒放在滤纸上干燥。包上牛皮纸灭菌。（三）离心管干燥后封口灭菌。（四）药勺用盐酸处理除去污渍锈斑，灭菌。（2）配LB培养基。（按照分子克隆实验指南配方）2L灭菌。预备明晚摇菌。（3）菌种活化，划单斑。取98.11的DJP菌种划单斑，37培养，预备明晚摇菌。Note： 提取Taq酶每次只用上次保存的菌种，每次摇菌后都要保存菌种！PROCEDURAL EXPLANATION：作蛋白表达的细菌和感受态细菌都要经过转瓶活化过程。第二天 准备工作（1）将昨晚划的平板放在4预备晚上摇菌。（2）配溶液Buffer A，Lysis Buffer，Storage Buffer并灭菌。Buffer A：50mM TrisHCl pH7.950mM Dextrose1mM EDTAK+配法：（FOR 400ml induce PreLysis Buffer）1M TrisHCl（pH7.9） 20ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.8ml Dextrose 3.6g加超纯水至390ml，pH计调至7.9，定容至400ml。Note：（一）pH值要在7.9以上，7.910以下。（用KOH和HCl调）（二）最后酶要悬浮在Buffer A中，因此要用超纯水。其他缓冲液用蒸馏水即可，也可用超纯水。Lysis Buffer：10mM TrisHCl （pH7.9）50mM KCl1mM EDTAK+（pH7.9）0.5%（v/v）Tween-200.5%（v/v）NP401mM PMSF（用前再加）配法：（FOR 200ml）1M TrisHCl（pH7.9） 2ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.4ml1M KCl 10ml10% Tween20 10ml10%NP40 10ml灭菌后加入PMSF 0.03484g。（以约300500l异丙醇溶解，缓慢加入）Note：PMSF可用异丙醇溶解后缓慢加入，也可直接将粉末倒进去剧烈振荡。（PMSF剧毒，注意防护）PreLysis Buffer：即Buffer A中加Lysozyme至4mg/ml。（现配现用）1Storage Buffer：（200ml，溶解酶用，-20保存）50mM TrisHCl（pH7.9）0.1mM EDTAK+50mM KCl0.5mM PMSF1mM DTT配法：1M TrisHCl（pH7.9） 10ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.04ml1M KCl 10mlPMSF 0.01743g定容至100ml，再加甘油100ml。灭菌后加入过滤除菌的DTT。1M DTT过滤除菌后加入0.2ml，即终浓度为1mM（配法：1.543g10ml超纯水或0.7715g5ml超纯水，过滤除菌后小管分装。-20保存）Note：（一）PMSF可用异丙醇溶解后缓慢加入，否则易析出。（二）DTT易降解，因此要在Buffer灭菌后加入，并且在低温保存。1Storage Buffer：（2L透析用）50mM TrisHCl（pH7.9）0.1mM EDTAK+50mM KCl0.5mM PMSF1mM DTT配法：1M TrisHCl（pH7.9） 100ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.4ml1M KCl 100ml PMSF 0.1743g定容至1000ml，再加甘油1000ml。灭菌后加入过滤除菌的DTT。1M DTT过滤除菌后加入2ml。（3）挑斑摇菌5ml LB加Amp至80g/ml。2管（用同一个斑，并标记该斑），37过夜。（本次试验中由20：309：30）第三天 酶的诱导表达（1）转瓶：LB加Amp至80g/ml(即浓度为100mg/ml的Amp在1L的培养基中加800l)，加菌液500l/L，37摇菌。预计21：00可加IPTG诱导。Note：本次试验中由10：3020：00，OD550值达到1.663，应在0.8左右最好。达到1.8亦可。（2）保存菌种：400l菌液加400l菌种保存液，-70保存。（3）清理器皿：检查是否有未灭菌的器皿，将用过的器皿清洗灭菌。（4）测OD值，加IPTG（250mg/ml）至125mg/L（0.5mM。500l1L）37摇菌，12hr。Note:（一）诱导IPTG一般加到1mM，诱导时间相对较短，2mM为饱和值。本次试验将浓度降低，时间相应延长，以便过夜摇菌。（二）加IPTG前取样（500l2）以备做蛋白胶对照。明早离心前再取样预备跑蛋白胶。菌液离心后收集菌体4保存。（三）IPTG诱导12hr，明早8：00前要调水浴锅至75（精确！）。同时离心转子预冷至4。第四天 提Taq酶为避免污染，所有操作都要戴手套，常换手套和枪头。（1）收集菌体：8：30离心，5000rpm，4，15min，500ml离心管2，收集两次，共2L。Note：以下操作在冰上进行，与制感受态类似。（2）洗涤：Add 100mlBuffer A per liter origin culture volume，转至250ml离心瓶2；6000rpm，4，12min，冰上。（3）PreLysis：Add 50ml PreLysis Buffer per liter origin culture volume（先加50ml Buffer A per liter，充分悬浮，再加Lysozyme至4mg/ml，摇匀），室温放置15min，合并至一个250ml离心瓶中。（4）热变性沉淀杂蛋白：在Lysis Buffer中加入PMSF，待用。加入等体积的Lysis Buffer，转入250ml三角瓶中，75，1hr。（5）除去沉淀：15000rpm或17000rpm（Beckman）4,15-20min。取上清，转入干净的三角瓶中，用灭菌的100ml量筒量取体积。（6）（NH4）2SO4沉淀Taq酶：用小烧杯称取硫酸铵（按30g/100ml上清）在室温慢加慢摇。边加边摇。本次试验摇了两个小时。Note：（一） 避免局部盐浓度过高导致Taq酶析出，要加一点摇一会。（二）摇烧杯时要注意不要产生泡沫，泡沫会使酶活性降低。（三）大约加入一半硫酸铵时溶液会浑浊，若沉淀出现太早表明杂蛋白未除尽，可在透析之后离心除去。（7）离心沉淀Taq酶：转入50ml离心管，15000rpm或18500rpm（Beckman）室温，25min。弃上清，沉淀重悬在5ml Buffer A per 100ml上清。Note：（一）若在4离心则沉淀很少。（二）上清可倒在三角瓶中多离心几次便可以将沉淀完全离心下来。（8）透析：将透析袋用透析夹夹紧，透析袋中避免有气泡，可用手将气泡挤出（戴手套！）每个透析袋约10ml在Storage Buffer中加入DTT（切记！）在1000ml烧杯中倒入约400500ml，放入磁转子，4缓慢搅拌，每隔12hr换一次透析液。Note：（一）透析袋可多折几次以免夹得不紧。（二）透析时烧杯要封口（可用PE手套）第五天 透析早晚各换一次透析液，原透析液倒掉，切勿造成酶的污染！Note：Storage Buffer平