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生化工程（生物化学技术原理与应用）题库一、名词解释Ks盐析：Cohn经验公式表明，当（蛋白种类，温度，pH）与Ks（盐种类）一定时，蛋白质溶解度的对数和该溶液的盐浓度呈反比关系。离子强度越大，蛋白质溶解度越小，直至沉淀。这种盐析方法即为Ks盐析。双水相层析：双水相萃取技术：利用溶质在两个互不相溶的水相之间的分配系数不同而进行分离的萃取技术。反萃取：为了进一步分离干扰物质， 或者被测组分萃入有机相后不便于后继的测定， 常须进行反萃取。将欲测组分从萃取相重新转入水相（原溶剂）。凝聚：指在某些电解质的作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成mm 大小块状凝聚体的过程。（凝聚是在高价无机盐作用下，由于经典排斥力的降低，而使胶体体系不稳定的现象。）蛋白质盐析：当盐浓度达到一定范围时，蛋白质溶解度随盐浓度的增加而降低并从溶液中析出，该技术称为蛋白质盐析。膜分离技术：在分子水平上，不同粒径的混合物在通过分离膜时实现选择性分离的技术。其实质是物质透过或被截留于膜的过程，即依据膜孔径的大小而达到物质分离的目的。双向电泳：第一向为定点聚焦电泳，使蛋白质在横向分离至各自等电点，第二向为SDS-PAGE，使蛋白在纵向按照分子大小进行分离。超临界流体：在超临界状态下，纯物质所呈现的流体状态，其体系性质均一，气液界面消失，既不是气体，也不是液体，称为超临界流体。排阻极限：不能进入到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量。（渗入极限：能够完全进入到凝胶网络内部的最大分子的相对分子量。）阴离子交换剂：功能基团带正电荷，与阴离子交换。（书：阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。因此这种交换剂可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺N（CH3）3、叔胺N（CH3）2、仲胺NHCH3和伯胺NH2）基团后构成的。阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。）交换容量：是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq/mg或meq/ml）表示。（书：是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。一般用总交换容量和有效交换容量表示。）层析技术：主体介质由互不相溶的流动相和固定相组成，利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。（层析是以基质为固定相（呈柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中连续不断、反复多次地进行分配或交换、吸附作用，最终达到分离混合物之目的。）矫正保留时间：（书P416）【死时间（tr0）：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据t0可求出流动相平均流速。（书：死时间是指不被固定相吸附或溶解的空气或甲烷，从进样口经过柱体出现浓度极大值所需的时间，即空气通过色谱柱所需要的时间。）保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。（指样品从柱口经过色谱柱出现浓度极大值时所需的时间，包括死时间与样品在两相中分配时间的总和。）调整保留时间tr：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即tr= tr tr 0。由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。（书：校正保留时间（tr）：是指保留时间扣除死时间，即样品组分在液相中保留的总时间。写成公式为：tr= tr tr 0。）】键合型固定相：（书：P147）将有机物质中的某些基团通过化学方法，以共价键方式制成成固定相。（用键合型固定相构成的色谱称为键合色谱。）二、填空题1.常见的破碎技术有机械破碎， 物理破碎 ， 化学破碎 以及 酶解破碎（生物酶解） 。2.常用的预处理技术有加热、调节pH值、 凝聚和凝絮 、 加辅助过滤剂（惰性助滤剂） 以及 加入反应剂 。3.离心力的常用表示方法两种，在低速条件下常用 转速 表示离心力，单位为 r/min（rpm） ；也可用 相对离心力（RCF） 表示离心力，单位为 g（重力加速度） 。4.常见的双水相系统有两大类型，一类为 高聚物/高聚物（PEG/DEX） ，另一类为 高聚物/盐（PEG/无机盐） 。5.超临界流体萃取的分离原理有三种， 等温变压 ， 等压变温 以及物理吸附法。（等温等压吸附法）6.离子交换剂由 载体 ， 电荷基团 和 平衡离子（反离子） 三部分组成。7.根据支持物的不同，层析技术可分为柱层析， 纸层析 和 薄层层析 。8.柱层析的主要构成部件包括色谱柱（层析柱），蠕动泵， 检测器 ， 记录仪 以及 收集器 。9.层析技术主要由固定相， 流动相 和 支持物 三部分构成。10.氨基酸的纸层析从原理上讲属于 分配层析 。（？）11.电泳技术是根据各种带电粒子在电场中 迁移率 的不同而对物质进行分离的一类实验技术。不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种分离效应，分别为 浓缩效应 ， 电荷效应 和 分子筛效应 。三、判断题（）1.纯酶和粗酶有相同的研习分级范围。（盐析范围）（）2.在每升溶剂中加入767g硫酸铵可达到100%饱和度，所以在50%饱和度的溶液中加入383.5g的硫酸铵可达到100%饱和度。（因为加入后体积变大）（）3.细胞破碎时细胞破碎强度越大，细胞碎片越小越好。（后续固液分离困难）（）4.离心时间越长对固液分离越有利。（可能导致非目标产物沉淀）（）5.纯化时应秉持先粗分后细分，先低成本后高成本，先高通量后低通量的原则。（）6.强酸强碱型的离子交换剂交换容量是测定其中和酸碱的能力。（）7.将少量离子交换剂与稀Nacl浸泡后溶液呈现酸性，表明该离子交换剂为阳离子交换树脂。（）8.离子交换剂筛孔越大越有利于蛋白的吸附。（）9.阳离子交换剂意味着与载体共价结合的电荷基团带有正电荷。（）10.为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子，但在分离蛋白时，一般不选择H型和OH根型，多选择Na型和Cl型。（）11.在分级沉淀实验中，同种酶的纯酶溶液和粗酶溶液的分级范围相同。（）12.沉淀与结晶均为固体析出技术，不过沉淀的析出物为无定形固体，而结晶的析出物则具有规则的排列。（）13.等电聚焦电泳可以测定蛋白质等电点。（）14.固液分离过程中，离心时间越长越好。（）15.生化工程分离方法选择合理的选择步骤应按照先低选择性，后高选择性；先低通量后高通量的原则来选择。（）16.排阻层析中凝胶粒度的大小对分离效果没有直接的影响。（）17.葡聚糖凝胶sephadexG-50，表示干胶吸水率，数字越大表示排阻极限越小。（）18.膜分离技术中的浓差极化现象是一个不可逆的过程。（）19.反相色谱中固定相的极性比流动相大。（）20.所有的化合物都可以用气相色谱分析。四、问答题1.相对于普通液相色谱而言，高效液相色谱有哪些优势？（6分）答：高效固定相：颗粒极细（一般为10 m以下）、规则均匀且耐压的固定相，（键合相）传质阻抗小，柱效高（2分）；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快（2分）；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达10-9g ，而荧光检测器最小检测限可达10-12g （2分）。2. 以PEG/DEX双水相系统为例，画简单示意图标出相图中的双节线、系线和K点，并说明各自的物理意义。（9分）画相图并说明相图的主要参数。相图：两水相形成的条件及定量关系。答：示意图。双节线（曲线TKB）：双水相形成分界线，上方为双水相，下方为均一相。系线（直线TMB）：系线上各点处系统总浓度不同，但均分成组成相同（T,B）而体积不同的两相。K点：系线的长度是衡量两相之间差别的尺度，系线越长，两相间差别越大，反之则越小。在K点系线长度趋向为零，两相差别消失，任何溶质在两相间的分配系数均为1，此点称为临界点。3.设计利用离子交换剂分离一种含有等电点分别为4.0，6.0，7.5和9.0的蛋白质混合溶液的方案，并简述理由。（书：P91）（7.0、8.0、9.5 pH梯度洗脱。）答：提示：此题可以有多种设计方案，但必需包含以下内容：离子交换剂的选择：必需选择亲水性粒子交换载体（2分）理论上既可以选择阳离子交换基团也可以选择阴离子交换基团，但所选择的交换基团必需和上样缓冲液以及洗脱过程相一致（3分）要明确操作步骤，包括装柱、上样、平衡、洗脱、收集、柱再生。（5分）洗脱方法切实可行，尽量选择盐洗脱，pH梯度洗脱有局限。选用纤维素离子交换剂。因为蛋白质不能扩散到树脂的链状结构中，而纤维素离子交换剂交换容量大。选用pH=5.0的磷酸缓冲液和强酸型阳离子交换剂如SE-纤维素。装柱用NaCl处理，0.1mol/L起始缓冲液平衡，上样，吸附目标蛋白，0.15mol/L缓冲液洗脱，之后再选用pH=7.0、8.0的缓冲液梯度洗脱，pI=4.0的蛋白质在pH=5.0的缓冲液中带负电，不能被吸附，直接分离。随后pI=6.0的蛋白质被洗脱出来，再用pH=8.0缓冲液洗出pI=7.5的，最后选用pH=9.5的缓冲液洗脱pI=9.0的蛋白质，即分离完成。4.评价纯化方案的指标那些？如何评价纯化方案的可行性。（书：P16）答：评价纯化方案的指标有：a比活性（活性单位数/毫克蛋白数）（2分）；b纯化倍数（每步的比活性/粗提液的比活性）（2分）；c收得率（每步的总活性/粗提液总活性）100%（2分）。判断纯化方案合理性的标准是能较快增大纯化倍数而较缓慢降低收得率的方法是比较合理的（2分），反之则应用价值不大，不宜采用。但是在纯化过程中，随着纯化倍数的增大，往往收得率会减少，实践中要求根据实验材料来源难易程度的变化而取舍（2分）。但是，在纯化过程中，随着纯化倍数的增大，有效成分的含量却是逐渐减少，收得率也往往小于100%（除非抽提液中存在酶的抑制物）。因此，实践中对纯化倍数和收得率的要求是根据材料来源的难易而变化的。若材料来源难，就希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数（见沉淀法）。（1）比活性/（U/mg）；纯化倍数；收得率/%。（2）总指标：提高和矛盾。所以，若原材料，则提高；若原材料，则提高。5.何谓层析技术？举例叙述四种层析技术及各自原理。（15分）答：层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，使各组分在固定相与流动相两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的技术（3分）。四种基本的层析技术包括分配层析、吸附层析、离子交换层析和排阻层析，其基本原理如下：分配层析（1分），以互补相溶而极性相异的为固定相和流动相（1分），其原理是通过各组分溶解度的不同进行分离（1分）；吸附层析（1分），以吸附剂为固定相（1分）通过疏水力和静电引力来分离组份（1分）；离子交换层析（1分），以离子交换剂为固定相（1分），通过离子键结合力来分离各组份（1分）；排阻层析（1分），以分子筛为固定相（1分），通过排阻效应来分离各组份（1分）。6.简述离子交换，凝胶过滤，吸附层析以及分配层析分离大分子的基本原理（1）离子交换：离子交换层析：是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的带电粒子进行可逆的交换性质来分带电粒子型混合物的层析方法，溶液中的带电粒子因于固定相之间结合力差异而得到分离。平衡阶段：离子交换剂与反离子结合；吸附阶段：样品与反离子进行交换；、解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质（），然后洗下强吸附物质（）；再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用。（2）凝胶过滤：利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析。凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们即能在凝胶颗粒外分布，也能部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。（书：凝胶过滤层析所用的载体是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以全部或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透。任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0100%，其被排阻的程度可以用分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小依赖于凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo），以及分离物本身的洗脱体积（Ve），即Kav=（Ve - Vo）/（Vt - Vo）。）（3）吸附层析：利用固定相吸附剂对混合物中各组份吸附能力的差异而使混合物中各组份得以分离的色谱方法。固定相吸附剂：吸附剂：多孔颗粒，具有较大表面积；表面有许多吸附中心；吸附力：范德华力，静电吸引力。吸附特点：无选择性，但结构相似则更容易吸附，因而极性物质容易吸附在极性吸附剂上，反之亦然，但同时要考虑解吸附的因素。吸附能力决定洗脱顺序：吸附剂对被分离物质吸附力越强，被分离成分吸附得越牢固，在色谱中的移动速度则越慢，洗脱体积越大，反之亦然。（书：在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德华力（中性分子彼此距离非常近时，产生的一种微弱电磁引力）和静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合，其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。因此，混合物在层析柱中的分离过程，实质上是吸附、解吸附、再吸附的连续过程，或者是在固定相与流动相之间连续分配的过程。）（4）分配层析：互不相邻两相中分配系数的不同。分配层析法的原理：被分离组分在固定相与流动相之间的分配性质（溶解能力）不同而实现分离。分配层析的构成要素：固定相：极性或非极性溶剂，固定相=支持物+液膜。流动相：极性或非极性溶剂。洗脱速度与固定相和流动相的关系：在固定相中分配系数大，洗脱慢。在固定相中分配系数小，洗脱快。正相层析与反相层析：正相层析：固定相极性大于流动相极性的层析方法。固定相常采用硅胶为支持剂，水等为液膜，流动相为小极性或中等极性有机溶剂。反相层析：固定相极性小于流动相极性的层析方法。固定相为非极性，流动相多为水、乙腈、甲醇等强极性溶剂。7.超临界流体萃取技术中为何选用二氧化碳超临界流体作为萃取剂？（临界T、P、可获得性）超临界CO2流体萃取的优点：（1）CO2的临界温度接近于室温（31.1），适合于热敏性物质，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发度，易热解的物质分离出来；（2）CO2的临界压力（7.39MPa）适中，目前工业水平易达到；（3）CO2的临界密度是常用超临界溶剂中较高的，即溶解能力较好；（4）CO2无毒、无味、不燃、不腐蚀、价廉，易于精制、易于回收，无污染。8.简述胞内可溶性蛋白制备的一般过程。9.现有肌苷样品溶液100ml，浓度为2mol/L，若每g干树脂（膨胀度为1.5）总交换容量为3.5mmol，而实际交换容量是总交换容量的5%，问使用多长的层析柱（直径：长度=1：10）为宜？（60.22cm）（书：P90）肌苷物质的量n=cv=2mol/L0.1L=0.2mol实际交换容量为3.5mmol量/g5%=0.175mmol量/g=0.175mol量/kg所以0.2mol量肌苷全部交换，需干树脂的量为0.20.175=1.14kg干树脂由于膨胀度为1.5，所以柱体积应为1.141.510000=R2L，且D：L=2R：L=1：10,所以长度L=60.22cm10.简述柱层析的一般操作步骤。（装柱、上样、平衡、洗脱、收集、柱再生）（1）样品的选择与预处理。（2）装柱。将层析柱垂直固定，一般是先在柱内装入约1/3高度的水或缓冲液排走空气。要求柱子装的均匀，不分层，无气泡。（3）平衡。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使介质充分平衡，柱床稳定。（4）上样（加样）。打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到柱面。沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到柱面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。加样时应尽量减少柱面的搅动。（5）洗脱与收集。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。流速不宜过快且要稳定，洗脱液的成分也不应改变（凝胶溶胀程度），整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，可以用水或缓冲液作洗脱液。（6）再生与保存。用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用。11.在凝胶过滤分离某有效成分时，洗脱体积为140mL，其外水体积为60mL，总液体体积为200mL，计算该有效成分的分配系数。Kd=（140-60）/（200-60）=0.57分配系数Kd：12.举例说明凝胶过滤层析的应用及其机理（三个即可）。（书：P107）凝胶过滤层析的应用：组分离；分级分离；测定蛋白质分子量；测定蛋白质均一性。应用：凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。（书：脱盐和浓缩：根据盐类小分子物质可以进入凝胶筛孔中，而大分子物质则被排阻在其外的原理，可应用凝胶层析法除去蛋白质等溶液中的盐类，从而使其能与盐类分开。此外，利用凝胶的吸水性能，对生命大分子溶液进行浓缩也是很有效的。一般用于这些操作的材料是细颗粒葡聚糖凝胶G-25。分离生命物质：对于某些理化性质相似（如溶解度、带电性）而分子质量不同，或者是聚合体不等的混合溶液，采用凝胶过滤法就很容易分离。例如，用葡聚糖凝胶G-150能方便地将人和牛的血清蛋白中的单体和二聚体分开。去除热源物质：去除热源物质常常是各种注射剂制备过程中的一个难题。所谓热源物质可能是糖蛋白一类大分子物质。一般在制备水解蛋白、核苷酸和酶注射液时，采用凝胶过滤法去除热源物质效果较好。例如，采用葡聚糖凝胶G-25（80120目）凝胶层析柱（6cm85cm）去除氨基酸粗制品中的热源物质时，每次加入氨基酸粗制品（20%）350ml，用无热源物质的蒸馏水洗脱，流速为4ml/min，所有蛋白质的Kav值等于零，故能被完全排除。而氨基酸的Kav值近似1，若试液量为柱体积的20%30%时，能完全分离开。测定分子质量：将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱以相同条件进行层析。由于加入凝胶柱的物质分子质量不同，故洗脱体积也不一样。根据洗脱体积求出Kav值，而Kav值与蛋白质分子质量之间又存在线性关系（即Kav=blgM+c），因此，可以绘出一条标准曲线。尔后，在同样条件下，由未知分子质量物质的洗脱体积可求出其Kav值，以此值在标准曲线上就能求出其分子质量。如葡聚糖凝胶薄板测定蛋白质分子质量。）13.简要说明高效液相层析与气象色谱的异同点。液相色谱（LC）：以固体作为流动相的色谱技术。【高效液相色谱（HPLC）】气相色谱（GC）：以气体作为流动相的色谱技术。高效液相色谱：是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法。HPLCGC适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析（80%）适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析（20）流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用流动相只起运载样品分子的能力常温下进行，不需要高柱温样品需气化，分离过程恒温14.请按照下图列出的数据计算A物质的含量。（第七章）内标法需要内标物。目标组分和内标物被检测到，就可定量。可减小进样量的误差对结果的影响。定量结果最为准确内标物必须准确添加入所有未知样品中。浓度比X=0.71.2=0.58，组分A的浓度为：100ppm0.58=58ppm1.双向电泳（第六章，书P347）双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿p梯度分离至各自的等电点。随后，再沿垂直的方向进行SDS-PAGE，按照分子量大小进行分离。特点：分辨率高；高重复率。2.膜分离（第五章）（1）膜分离技术：在分子水平上，不同粒径的混合物在通过分离膜时实现选择性分离的技术。其实质是物质透过或被截留于膜的过程，类似于筛分过程，即依据膜孔径的大小而达到物质分离的目的。（2）特点：物质在膜分离过程中不发生相变；具有浓缩和纯化双重功效，选择性较高；常温下进行，由压力驱动，特别适合热敏物质；分离装置简单，操作容易。3.膜污染（第五章）什么是膜污染？如何减轻膜污染？（7分）答：膜污染：在膜过滤过程中，溶剂中的颗粒、胶体粒子或大分子溶质由于与膜 理化学相互作用或机械作用而引起在膜表面或膜孔内发生吸附、沉积、造成膜 或堵塞，从而使膜的通透量与分离特性发生不可逆变化现象。（3分）减轻膜勿让 措施：对料液进行预处理（过滤，调节pH）（1分）；膜运行方式的选择及 制：选择错流过滤，并控制溶液的温度、流速度，流动状态与压力等（1分）； 系统的设计：提高传质系数或选择通量较小的膜（1分）；及时对膜组件进行清洗 （1分）。膜污染：在膜过滤过程中，由于浓度差极化、大颗粒溶质的吸附和吸附层的聚合三种情况下所导致的膜的通透流量与分离特性发生不可逆变化的现象。膜污染的特点：膜通透量下降，通过膜的压力和膜两侧的压力差逐渐下降，分离物的截留率下降。4.如何减少膜污染（第五章）改善膜污染的方法：（1）样品处理：料液进行预处理，除去较大颗粒；调节pH远离蛋白质等电点。（2）采取错流操作并增加紊流器。（3）控制溶液温度、流速、流动状态、压力等。（4）膜组件的清洗：物理清洗/化学清洗。5.SDS-page测定蛋白质分子量的基本原理。（第六章，书P354-355）3.简述SDS-PAGE测定蛋白质分子量